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Synthesis of homogeneously N-glycosylated soluble Fas ligand variants
Alanca Schmid
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doktoratsstudium NAWI aus dem Bereich Naturwissenschaften (DissG: Chemie)
Betreuer*in
Christian Friedrich Wilhelm Becker
DOI
10.25365/thesis.72205
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-24037.14196.654484-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der Fas Ligand ist ein Transmembranprotein, welches von aktivierten T-Zellen, natürlichen Killerzellen und in immunprivilegiertem Gewebe exprimiert wird. Zusammen mit dem dazugehörigen Rezeptor bildet es einen Teil des extrinsischen Apoptoseweges und spielt daher eine wichtige Rolle im Immunsystem, in der T-Zellen Regulierung so wie in der Entstehung mancher Krebsformen. Jedoch konnte in den vergangenen Jahren gezeigt werden, dass der Fas Ligand auch an nicht-apoptotischen Signalwegen beteiligt ist. Speziell der sogenannte lösliche Fas Ligand scheint weitere Funktionen außerhalb der Induktion von Zellapoptose zu besitzen. Da Veränderungen in diesen hoch aufeinander abgestimmten Prozessen zu diversen Erkrankungen führen können und es bekannt ist, dass posttranslationale Modifikationen oft in diese krankheitsbedingten Umwandlungen involviert sind, wollen wir den Einfluss der N-Glykosylierung auf verschiedene Parameter wie zum Beispiel Rezeptorbindung oder die Aktivierung verschiedener Signalwege untersuchen. Um den Effekt der individuellen Glykanstrukturen an spezifischen Positionen innerhalb des Proteins untersuchen zu können, ist es sehr wichtig, Zugang zu homogen glykosylierten Proteinen zu haben. Um solche homogen glykosylierten Varianten des löslichen Fas Liganden zu erhalten, wurde ein chemoenzymatischer Ansatz verwendet. Das Protein wurde aus drei Teilen, welche alle mittels Festphasen Peptidsynthese hergestellt wurden, unter Verwendung der nativen chemische Ligation und der Diselenide-Selenoester Ligation zusammengebaut. An den nativen Glykosylierungsstellen wurden Asparagin-GlcNAc Bausteine eingesetzt, welche später enzymatisch glykosyliert werden können. Verschiedene Techniken zur Verbesserung der Löslichkeit und zur Erhöhung der Ausbeute wurden getestet. Die Kombination von Peptiden ohne löslichkeitsfördernde Elemente und der Tatsache, dass DSL-Reaktionen schon bei mikromolaren Konzentrationen ablaufen, führte schlussendlich zur Produktbildung. Nach der Deselenierung und dem Entfernen aller Schutzgruppen konnte sFasL141-281 erhalten werden. Eine homogene N-Glykan Grundstruktur, welche aktiviert und anschließend auf einen Asn-GlcNAc Baustein übertragen werden kann, wurde durch Isolierung von Sialoglycopeptid aus Eigelb und anschließendem enzymatischen Kürzen der Glykanstruktur erhalten. Nach der Aktivierung des so erhaltenen Tetrasaccharids können Endoglycosynthasen zur Übertragung verwendet werden, um den ortsspezifischen Einbau homogener N-Glykanstrukturen abzuschließen. Die homogene Verlängerung dieser Grundstruktur mit verschiedenen Glycosyltransferasen kann zu weiteren homogen glykosylierten Varianten führen. Leider konnte die Übertragung nur erfolgreich durchgeführt werden, wenn ein kurzes Testpeptid als Substrat verwendet wurde, bei der Verwendung von sFasL247-281 konnte keine Produktbildung beobachtet werden, sehr wahrscheinlich auf Grund von Löslichkeitsproblemen oder Interaktionen des Selenocysteins mit dem Enzym.
Abstract
(Englisch)
Fas ligand is a transmembrane protein expressed on activated T-cells, natural killer cells and immune privileged tissue. Together with its correspondent receptor, it is part of the extrinsic apoptosis pathway, playing an important role in the immune system, T-cell regulation and cancer development. However, in recent years it could be shown that FasL is also involved in many non-apoptotic signaling pathways. Especially the so-called soluble Fas ligand (sFasL), seems to exhibit a quite different set of functions. Since alterations in these highly concerted processes frequently lead to several forms of diseases and it is known that posttranslational modifications are often involved in disease related transformations, we wanted to investigate the influence of N-glycosylation of sFasL on different parameter, such as receptor binding or the induction of different signaling pathways. To investigate the impact of individual glycan structures at specific positions in proteins, access to homogeneously glycosylated protein variants is urgently needed. To obtain such homogeneously N-glycosylated variants of sFasL, a chemoenzymatic approach was chosen. The protein was assembled from three segments, synthesized by solid phase peptide synthesis, using native chemical ligation and diselenide-selenoester ligation (DSL). At the native glycosylation sites, asparagine-GlcNAc building blocks were introduced for subsequent enzymatic glycosylation. Different techniques to enhance solubilization and ligation yields were tested. Finally, using peptides without solubilizing elements in DSL reactions, exploiting the fact that this kind of reaction proceeds even at micromolar concentrations, led to the formation of full-length protein. After deselenization and protecting group removal, final sFasL141-281 could be obtained. A homogeneous N-glycan core structure which can be activated and transferred to Asn-GlcNAc was obtained by isolating sialoglycopeptide (SGP) from egg yolk and further enzymatically trimming it down. After activation of the tetrasaccharide, endoglycosynthases can be used to transfer the carbohydrate structure to a GlcNAc containing peptide, forming site specifically introduced homogeneous N-glycan core structures. Subsequent elongation could further increase the number of accessible glycopeptide variants. Unfortunately, tetrasaccharide transfer was only successful using a short testpeptide and not sFasL247-281, most likely due to solubility issues or interaction of the enzyme with the selenocysteine.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Chemische Biologie Peptidsynthese native chemische Ligation diselenide-selenoester Ligation N-Glykosylierung enzymatische Glykosylierung positions-spezifische PTM Proteinsynthese
Schlagwörter
(Englisch)
chemical biology peptide synthesis native chemical ligation diselenide-selenoester ligation N-glycosylation enzymatic glycosylation site-specific PTM protein synthesis
Autor*innen
Alanca Schmid
Haupttitel (Englisch)
Synthesis of homogeneously N-glycosylated soluble Fas ligand variants
Paralleltitel (Deutsch)
Synthese von homogen N-glykosylierten Varianten des löslichen Fas Liganden
Publikationsjahr
2022
Umfangsangabe
x, 217 Seiten
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Anna Maria Papini ,
Xuechen Li
AC Nummer
AC16605710
Utheses ID
64031
Studienkennzahl
UA | 796 | 605 | 419 |