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An inducible dual-guide CRISPR/Cas9 approach resolves the cellular assembly and functions of mammalian RNA exosome subunits
Nikolaus Beer
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Stefan Ameres
DOI
10.25365/thesis.72082
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30109.19724.709346-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das RNA-Exosom ist ein evolutionär konservierter 3´-5´-Exoribonuklease-Komplex mit mehreren Untereinheiten, der an der Verarbeitung und/oder dem Abbau fast aller RNA-Klassen beteiligt ist, und für das Überleben von Organismen essenziell ist. In Eukaryonten besteht das RNA-Exosom aus einem katalytisch inerten Kern, der aus neun einzigartigen Untereinheiten (Exosc1-9) besteht. Der Kern dient als wesentliches Gerüst für die RNA-Verarbeitung und den RNA-Abbau, was durch assoziierte Exoribonukleasen der Dis3-Familie (Dis3 im Zellkern und Dis3L im Zytoplasma) und Exosc10 (im Nukleolus) bewerkstelligt wird. Während die Struktur des RNA-Exosoms und viele seiner molekularen Substrate eingehend untersucht wurden, ist ein umfassender Überblick über die physiologische und molekulare Funktion der einzelnen Komponenten des Komplexes sowie der intrazellulären Assemblierung nach wie vor kaum bekannt. Dies liegt nicht zuletzt daran, dass es an experimentellen Systemen mangelt, die es erlauben, systematisch in essenzielle Proteinkomponenten einzugreifen, welche schädliche nachgelagerte Konsequenzen berücksichtigen. Hier habe ich einen Doxycyclin-induzierbaren Dual-Guide-CRISPR/Cas9-Ansatz in embryonalen Stammzellen der Maus etabliert, der das systematische parallele Ausschalten essenzieller Genprodukte in Zeitskalen ermöglicht, welche direkte molekulare und phänotypische Konsequenzen aufzeigen. Durch die umfassende Anwendung dieser experimentellen Strategie auf einzelne Komponenten des RNA-Exosoms und in Kombination mit Zellwachstumskonkurrenz-Assays konnte ich die essenzielle Funktion von Komplexbe-standteile bestätigen, mit Ausnahme der peripheren Komponente Exosc1. Tatsächlich ergab die RNA-Sequenzierung, dass der Abbau von Promoter-Upstream-Transkripten (PROMPTs) - Transkriptionsnebenprodukte, die vom nukleären RNA-Exosom abgebaut werden - im Vergleich zu allen anderen Kernkomponenten deutlich weniger von Exosc1 abhängig war, was darauf hindeutet, dass Exosc1 für die Funktion des RNA-Exosoms zumindest teilweise entbehrlich ist. Schließlich führte ich systematische quantitative Western-Blot-Analysen durch, um die Co-Destabilisierung von Exosom-Komponenten zu messen, wodurch die zelluläre Hierarchie der RNA-Exosom-Komplexbildung aufzeigt werden konnte. Im Gegensatz zu einem früher vorgeschlagenen Modell, das die Beteiligung von vorgebildeten Dimeren nahelegt, sprechen meine Beobachtungen für ein sequenzielles Assemblierungsmodell, das auf der anfänglichen Assoziation eines Trimers, bestehend aus Exosc2, 4 und 7, beruht, gefolgt von der schrittweisen Rekrutierung von Exosc7, 8, 9, 5 und 3. Bemerkenswert ist, dass die Bildung eines solchen oktameren RNA-Exosom-Kerns erforderlich ist, um die zytoplasmatische katalytische Komponente Dis3L zu stabilisieren, nicht aber ihres nuklearen Gegenstücks Dis3. Im Einklang mit der phänotypischen Entbehrlichkeit von Exosc1 ist dessen Assoziierung mit dem oktameren Kern des RNA-Exosoms lediglich zur Stabilisierung der nukleären Exoribonuklease Exosc10 erforderlich. Eine Klärung der Rolle von Exosc1 in der Funktion des RNA-Exosoms bedarf damit weiterer Nachforschungen. Zusammenfassend wurde mit dieser Arbeit eine experimentelle Strategie für zeitaufgelöste Loss-of-Function-Tests von essenziellen Genen in murinen Stammzellen etabliert, durch welche Exosc1 als teilweise entbehrliche und periphere Komponente des ansonsten essenziellen RNA-Exosom-Kernkomplexes dargestellt und noch neue Einblicke in die zelluläre Assemblierung des RNA-Exosoms offenbart werden konnten.
Abstract
(Englisch)
The RNA exosome is an evolutionary conserved 3´ to 5´exoribonuclease multi-subunit complex involved in the processing and/or degradation of almost every class of RNA to sustain organismal viability. In eukaryotes, the RNA exosome is composed of a catalyti-cally inert core that consists of nine unique subunits (Exosc1-9) which have been pro-posed to form an essential scaffold for RNA processing and decay mediated by associated exoribonucleases of the Dis3-family (Dis3 in the nucleus and Dis3L in the cytoplasm) and Exosc10 (in the nucleolus). While the structure of the RNA exosome and many of its molecular substrates have been extensively studied, a comprehensive view on the physio-logical and molecular function of individual core complex components as well as their cellular assembly remains poorly understood. This is not least due to the lack of experi-mental systems that allow to systematically interfere with essential protein components at timescales that account for detrimental downstream consequences. Here, I established a doxycycline-inducible dual-guide CRISPR/Cas9 approach in mouse embryonic stem cells that enables the systematic parallel depletion of essential gene prod-ucts at timescales that expose direct molecular and phenotypic consequences. By compre-hensively applying this experimental strategy to individual components of the RNA exo-some and combining it with cell growth competition assays, I confirmed the essential function of most complex constituents except for the peripheral component Exosc1. In fact, RNA sequencing revealed that the degradation of promoter upstream transcripts (PROMPTs) – transcriptional byproducts that are degraded by the nuclear RNA exosome – were substantially less dependent on Exosc1 when compared to all other core compo-nents, suggesting that Exosc1 is at least partially dispensable for RNA exosome function. Finally, I performed systematic quantitative Western blot analyses to assess the co-destabilization of exosome components, which revealed a cellular hierarchy of RNA exo-some complex formation. In contrast to a previously proposed model that suggested the involvement of pre-formed dimers, my observations strongly support a sequential assem-bly model, which relies on the initial association of a core-trimer consisting of Exosc2, 4 and 7, followed by the stepwise recruitment of Exosc7, 8, 9, 5 and 3. Notably, the for-mation of such an RNA exosome octameric core is required to stabilize the cytoplasmic catalytic component Dis3L but not its nuclear counterpart Dis3. Consistent with the phe-notypically dispensable role of Exosc1, its association with the RNA exosome octameric core is merely required to stabilize the nuclear exoribonuclease Exosc10 and determining its role in RNA exosome function warrants further investigation. In summary, this thesis establishes a novel experimental strategy for time-resolved loss-of-function assays of essential genes in mouse embryonic stem cells, establishing Exosc1 as a partially dispensable and peripheral component of the otherwise essential RNA exo-some core complex and revealing unprecedented insights into the cellular assembly of the RNA exosome.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
RNA Abbau RNA Prozessierung in vivo Protein-Komplexbildung RNA-Exosom CRISPR Cas9 Genom-Editierung
Schlagwörter
(Englisch)
RNA degradation RNA processing in vivo protein complex assembly RNA exosome CRISPR Cas9 genome engineering
Autor*innen
Nikolaus Beer
Haupttitel (Englisch)
An inducible dual-guide CRISPR/Cas9 approach resolves the cellular assembly and functions of mammalian RNA exosome subunits
Paralleltitel (Deutsch)
Ein induzierbarer Dual-Guide-CRISPR/Cas9-Ansatz entschlüsselt den zellulären Aufbau und die Funktionen von RNA-Exosom-Untereinheiten bei Säugetieren
Publikationsjahr
2022
Umfangsangabe
III, 60 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Stefan Ameres
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie
AC Nummer
AC16599126
Utheses ID
64098
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |