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Identification and characterization of novel regulators in hematopoietic stem cells
Anna Gemza
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Martin Leeb
DOI
10.25365/thesis.72326
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-14116.62054.523960-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Hämatopoetische Stammzellen (HSZ) gehören zweifellos zu den am besten charakterisierten Gewebestammzelltypen im menschlichen Körper. Jahrzehntelange Forschung und Entwicklung auf dem Gebiet der Stammzellbiologie führten zu Fortschritten im Verständnis der Mechanismen, die die Funktionen der HSZ steuern. Das regenerative Potenzial von HSZ hat den Weg für ihren Einsatz zur Behandlung von vielen Krankheiten geebnet. Jedoch bleiben trotz der umfangreichen Forschung auf diesem Gebiet die Mechanismen, die die Selbsterneuerung der HSZ steuern, noch weitgehend ungeklärt. Diese Tatsache schränkt die Entwicklung von Strategien ein, die darauf abzielen, HSZ für den klinischen Nutzen in vitro zu expandieren. Die ex vivo Expansion transplantierbarer Stammzellen ist eine vielversprechende Strategie für HSZ, die aus Nabelschnurblut (NSB) gewonnen werden, da es sich dabei um eine wertvolle Quelle für Stammzellen handelt. Die geringe Anzahl von HSZ in einer NSB- Konserve stellt jedoch das größte Hindernis für die Verwendung dieser HSZ für allogene Transplantationen dar. Das Ziel dieser Arbeit war es, neue genetische Regulatoren von NSB-HSZ für die ex vivo Expansion zu identifizieren und die molekularen Mechanismen, die an der Zellregulation nach der Stilllegung der ausgewählten Kandidatengene beteiligt sind, zu erforschen. Zur Identifizierung neuer Modulatoren von NSB-HSZ wurden ausgewählte Kandidatengene mithilfe eines lentiviral-vermittelten RNAi-Ansatzes stummgeschaltet. Anschließend wurden die Gen-Silencing-Effekte in Langzeitkulturen bewertet. Kandidatengene, die ein erhöhtes proliferatives Potenzial in Kombination mit der Aufrechterhaltung eines primitiven Phänotyps aufwiesen, wurden einer Genexpressionsanalyse unterzogen. Dies war gefolgt von Assays, die darauf abzielten, die molekularen Mechanismen zu verstehen, die die Stammzellexpansion vorantreiben. Unter den ausgewählten Kandidaten identifizierten wir TSEN15 als einen potenziellen negativen Regulator der HSZ-Vermehrung. TSEN15 ist ein Teil des TSEN-Komplexes, der die Exzision von Introns aus Vorläufer-tRNA-Molekülen katalysiert. Die Stilllegung von TSEN15 mithilfe von shRNAs in humanen NSB-CD34+ Zellen führte zu einer erhöhten Zellexpansion und einer Akkumulation von primitiven CD34+CD90+ Zellen. Neben den Auswirkungen auf die Stammzellexpansion haben wir auch den multipotenten Charakter von HSZ nach der Stilllegung von TSEN15 untersucht. Wir konnten beobachten, dass die Stilllegung von TSEN15 die klonogene Kapazität der Zellen nicht beeinflusst hat. Allerdings zeigten diese Zellen eine verminderte CD71-Expression auf erythroiden Vorläuferzellen, während die Expression der myeloiden Marker CD11b und CD15 erhöht war, was darauf hindeutet, dass die Stilllegung von TSEN15 eine Verzerrung in Richtung der myeloiden Zellproduktion verursachen kann. Auch wenn weitere Untersuchungen erforderlich sind, kann TSEN15 als ein neuer potenzieller Regulator der ex vivo Expansion von NSB-HSZ betrachtet werden.
Abstract
(Englisch)
Hematopoietic stem cells (HSCs) are doubtless one of the best functionally characterized tissue stem cell types in the human body. Decades of research and development in the area of stem cell biology led to great advances in the understanding of the mechanisms controlling hematopoietic stem cell functions. The incredible regenerative potential of HSCs has paved the way for their therapeutic use to treat a broad range of diseases. However, despite the extensive research in this field, the mechanisms that govern HSC stemness remain poorly understood. This fact unfortunately restricts the development of strategies that aim to expand HSCs for clinical benefits. Ex vivo expansion of transplantable stem cells is an especially promising strategy for umbilical cord blood (UCB)-derived HSCs, which could be utilized as an alternative source to bone marrow (BM)-derived stem cells. However, the low number of HSCs in a single cord blood unit stands out as the major obstacle for the use of UCB for allogeneic transplantations. The aim of this thesis was to discover novel genetic regulators of UCB-HSC expansion and to explore the molecular mechanisms, which are involved in cell regulation after silencing of the selected candidates. For identification of novel modulators of UCB-derived HSCs, selected candidate genes were silenced using a lentiviral-mediated RNAi approach, followed by the assessment of the gene silencing effects in long-term cultures of HSCs. Candidate genes, which exhibited an enhanced proliferative potential combined with the maintenance of a primitive phenotype, were subjected for gene expression analysis, followed by assays that aimed to understand the molecular mechanisms, which drive stem cell expansion. Among the selected candidates, we identified tRNA splicing endonuclease subunit 15 (TSEN15) as a potential negative regulator of HSC propagation in vitro. TSEN15 is part of the human tRNA-splicing endonuclease (TSEN) complex, which catalyzes the excision of introns from precursor-tRNA molecules. Knockdown of TSEN15 by shRNAs in primary human UCB CD34+ cells resulted in an increased cell expansion in culture and an accumulation of primitive CD34+CD90+ cells compared to the control. Beyond the effects on stem cell expansion, we also evaluated the multipotent character of HSCs to differentiate into mature blood cells upon TSEN15 inhibition. We could observe that knockdown of TSEN15 did not affect the overall clonogenic capacity of the cells. However, TSEN15-targeted cells exhibited a reduced CD71 expression on erythroid progenitors, while expression of the myeloid markers CD11b and CD15 was elevated, thus indicating that TSEN15 knockdown may cause a skewing towards myeloid cell production. Even though further investigations are required, TSEN15 can be considered a novel potential modulator of human UCB-HSC propagation ex vivo.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Hämatopoietische Stammzellen RNA Interferenz Ex Vivo Expansion
Schlagwörter
(Englisch)
Hematopoietic stem cells RNA interference Ex Vivo Expansion
Autor*innen
Anna Gemza
Haupttitel (Englisch)
Identification and characterization of novel regulators in hematopoietic stem cells
Paralleltitel (Deutsch)
Identifizierung und Charakterisierung neuer Regulatoren in hämatopoetischen Stammzellen
Publikationsjahr
2022
Umfangsangabe
77 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Martin Leeb
AC Nummer
AC16620077
Utheses ID
64631
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |