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Screening of natural products and derivatives for their influence on intracellular cAMP-levels for immunomodulation
Dorothee Maria Michels
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Pharmazie
Betreuer*in
Verena Dirsch
Mitbetreuer*in
Alexander Perhal
DOI
10.25365/thesis.72338
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-17608.66937.689068-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der sekundäre Botenstoff zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) ist sowohl für das angeborene als auch das erworbene Immunsystem von zentraler Bedeutung. Verschiedene etablierte therapeutische Strategien gegen entzündliche Erkrankungen sowie Autoimmunerkrankungen bauen auf den immunmodulatorischen Eigenschaften des cAMP auf. Dabei gibt es verschiedene Ansätze, den cAMP-Spiegel zu beeinflussen, wie eine Erhöhung des Spiegels durch Rezeptorstimulation durch Liganden oder durch eine Inhibierung des cAMP metabolisierenden Enzyms Phosphodiesterase (PDE). So ist es von großer Relevanz, neue Substanzen zu identifizieren, die durch die Beeinflussung des cAMP-Spiegels neue therapeutische Möglichkeiten bieten. Zahlreiche natürliche Substanzen vom DNTI-Projekt wie auch synthetisch hergestellte Verbindungen wurden in vitro in modifizierten HEK293 Zellen getestet, um deren Einfluss auf den intrazellulären cAMP-Spiegel zu bestimmen. Dabei wurden zwei Screenings mittels der FRET-basierten Fluoreszenzmessung durchgeführt, in welcher das Protein Epac als Biosensor für cAMP diente. Durch das Target-basierte Screening wurden Substanzen auf eine mögliche agonistische Aktivität am Gallensäurerezeptor TGR5 überprüft. Eine Erhöhung des cAMP-Spiegels im phänotypischen Screening wurde auf eine mögliche Hemmung des Enzyms PDE zurückgeführt. Im TGR5 Target-basierten Screening konnten mehrere Substanzen identifiziert werden, die eine signifikante Erhöhung des cAMP-Spiegels hervorgerufen haben. Um diese Ergebnisse auf den cAMP/CRE-Signalweg zurückzuführen, wurden auch CRE-Luciferase-Assays durchgeführt, die diese Ergebnisse bestätigten. Weiters wurde ein FXR-Gal4-Luciferase-Assay gemacht, um die Selektivität der Substanzen für TGR5 zu überprüfen. In früheren phänotypischen Screenings wurde bereits eine Erhöhung des cAMP-Spiegels durch die Magnolol-Derivate LRK071 und AH-17 als auch durch das Leoligin-Derivat 2743 beobachtet, welches auf eine mögliche Inhibierung des PDE-Enzyms zurückgeführt wurde. Um dieser Theorie nachzugehen, wurde eine kinetische cAMP-Messung und ein Fluoreszenzpolarisationstest mit dem Enzym PDE4B2 durchgeführt. Zudem wurden die Substanzen auch auf antiinflammatorische Eigenschaften mittels Griess-Assay sowie NF-κB- Luciferase-Assay überprüft. Sehr aussagekräftige Resultate brachten die kinetischen cAMP Messung sowie der Griess-Assay, während nicht signifikante und unspezifische Ergebnisse bei dem NF-κB-Luciferase-Assay und der Fluoreszenzpolarisationsmessung herausgekommen sind. Die Substanz LRK071 wurde auch auf mögliche andere Wirkmechanismen überprüft, wie eine mögliche PKA-Inhibierung mittels des CRE-Luciferase-Assays, eine mögliche Rezeptorstimulation mittels der kinetischen cAMP-Messung und eine mögliche Stimulation der Adenylatcyclase mittels des phänotypischen Screenings. Die Ergebnisse dieser drei Experimente untermauern die PDE-Inhibitor-Theorie. Aber dennoch sind weitere Experimente nötig, um den exakten Wirkmechanismus von LRK071 zu identifizieren.
Abstract
(Englisch)
The second messenger cyclic adenosine monophosphate (cAMP) plays a pivotal role in the innate as well as in the adaptive immune system. Hence, the modulation of the cAMP levels is the hub for several therapeutic strategies ranging from inflammatory to autoimmune diseases. The intracellular cAMP level can be affected via different mechanisms, for instance, the stimulation of G-protein coupled receptors (GPCRs) by ligands or the inhibition of the cAMP-metabolizing enzymes phosphodiesterases (PDEs). The discovery of new compounds which affect the cAMP levels would be a promising approach to examine further treatment strategies. Numerous natural compounds from the DNTI project as well as synthesized substances were screened in vitro in modified HEK293 cells to determine their potential influence on the cAMP levels. Therefore, two different screening assays were performed. A target-based screening was conducted to assess a potential agonistic activity on the bile acid receptor TGR5, while a phenotypic screening served to examine substances for potential PDE inhibitory activity. A Epac-based FRET biosensor assay was used in both screenings. Several compounds could be identified which significantly increased the cAMP levels in the TGR5 target-based screening. In addition, CRE-luciferase assays were performed to confirm their effect on the cAMP/CRE pathway in another assay. A FXR-Gal4-luciferase assay was conducted to examine the selectivity for the TGR5 receptor. In previous phenotypic screenings an increase of the cAMP levels was observed with the magnolol derivatives LRK071 as well as AH-17 and the leoligin derivative 2743. To find out if these compounds have a potential PDE inhibitory activity, a kinetic cAMP measurement and a fluorescence polarization assay with the enzyme PDE4B2 were performed. Furthermore, the compounds’ anti-inflammatory properties were tested in the Griess assay as well as in the NF-κB luciferase assay. Promising results were obtained in the Griess assay and in the kinetic cAMP measurement, while the results were not significant and difficult to interpret in the NF-κB luciferase assay as well as in the fluorescence polarization assay. Also, other mechanisms of action of LRK071 were tested, such as a potential PKA inhibitory activity with a CRE-luciferase assay, a potential receptor stimulation with a kinetic cAMP measurement as well as an adenylate cyclase stimulation in a phenotypic screening. The obtained results of these experiments support the theory that LRK071 might have a potential PDE inhibitory activity. However, further experiments are required to confirm this theory.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
cAMP Immunmodulation Naturstoffe Leoligin Derivate Magnolol Derivate
Schlagwörter
(Englisch)
cAMP immunomodulation natural products leoligin derivatives magnolol derivatives
Autor*innen
Dorothee Maria Michels
Haupttitel (Englisch)
Screening of natural products and derivatives for their influence on intracellular cAMP-levels for immunomodulation
Paralleltitel (Deutsch)
Screening von Naturstoffen und ihren Derivaten auf deren potenziellen Einfluss auf intrazelluläre cAMP-Levels zur Immunmodulation
Publikationsjahr
2022
Umfangsangabe
IV, 118 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Verena Dirsch
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines
AC Nummer
AC16628652
Utheses ID
64690
Studienkennzahl
UA | 066 | 605 | |