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Identification of allosteric modulators and investigations into the allosteric mechanism of the C-type lectins DC-SIGN and langerin
Hengxi Zhang
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doktoratsstudium NAWI aus d. Bereich Lebenswissenschaften (DissG: Pharmazie)
Betreuer*in
Christoph Johannes Heinrich Rademacher
DOI
10.25365/thesis.72658
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-21820.65600.834748-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die C-Typ-Lektine (CTLs) sind Mustererkennungsrezeptoren (PRRs), die eine Vielzahl von Liganden erkennen und verschiedene physiologische Prozesse regulieren. In unserem Körper unterscheiden CTLs zwischen Eigenem und Fremdem und vermitteln eine Immunantwort, indem sie invasive Pathogene erkennen und darauf reagieren. Daher spielen CTLs eine wichtige Rolle bei der Pathogenerkennung und der angeborenen Immunität. Die Entwicklung von Agonisten oder Antagonisten, die auf CTLs abzielen, ist ein möglicher Ansatz für immunmodulatorische Therapeutika. Aufgrund der geringen Arzneistofffähigkeit in Kohlenhydratbindungsstellen (CBS) wurde jedoch eine begrenzte Anzahl chemischer Sonden oder wirkstoffähnlicher Liganden gegen CTLs entwickelt. Jüngste Studien zeigen, dass allosterische Modulatoren aufgrund des geringen Evolutionsdrucks hochspezifisch sind. Folglich ist das Hauptziel dieser Arbeit, allosterische Stellen und Modulatoren zu identifizieren, die gegen die CTLs DC-SIGN und Langerin gerichtet sind. In dieser Studie wurden 61 Fragmente basierend auf einem 4-Chinolon-Gerüst synthetisiert und mit einem STD-Reporter-Assay gegen DC-SIGN gescreent. Die Bindungsaffinitäten wurden unter Verwendung von proteinbasiertem 1H–15N HSQC-NMR validiert. Schließlich zeigen wir basierend auf der Struktur-Aktivitäts-Beziehungs (SAR)-Studie, dass Ethoxycarbonyl oder Dimethylaminocarbonyl an den Positionen 2 oder 3 die Bindungsaktivität von DC-SIGN verstärkt, insbesondere in Kombination mit Fluor, Ethoxycarbonyl oder Dimethylaminocarbonyl an den Positionen 7 oder 8. Die Verwendung von 19F-Reporter-Verdrängungsassay (RDA)-NMR hat ferner nahegelegt, dass diese Chinolone das CBS allosterisch modulieren können, wodurch ein alternativer Ansatz für dieses herausfordernde Zielprotein bereitgestellt wird. Um die allosterische Bindungsstelle von zuvor gescreenten Thiazolopyrimidinen für Langerin zu identifizieren, begann unsere Forschung mit der Hypothese, dass die nicht konservierte kurze Schleife zwischen menschlichem Langerin (hLang) und murinem Langerin (mLang) für die Bestimmung der Bindungsspezifitäten zwischen zwei Homologen verantwortlich ist. Basierend auf dem Strukturvergleich und den MD-Simulationen weisen die nicht konservierten kurzen Schleifen einen hohen Grad an Konformationsflexibilität zwischen den hLang- und mLang-Homologen auf. Darüber hinaus zeigten Mutationsstudien und Sequenzanalysen, dass ein Paar von Resten für die Bestimmung der Bindungsspezifität von Thiazolopyrimidinen in verschiedenen Langerin-Spezies entscheidend ist. Durch die Kombination von NMR-Untersuchungen zur Erhöhung der paramagnetischen Relaxation (sPRE) mit Lösungsmitteln und Peptidbindungsstudien konnten wir definieren, dass die Spalte zwischen den kurzen und langen Schleifen die allosterische Bindungsstelle für diese aromatischen Heterocyclen bildet. Um die allosterische Stelle von DC-SIGN zu identifizieren, haben wir basierend auf MD-Simulationen eine Mutation M270F entworfen und synthetisiert. Durch die Verwendung von proteinbasiertem 1H–15N HSQC NMR konnten wir bestätigen, dass die Tasche zwischen α-Helix 2 und β-Blatt 0 und 1 eine sekundäre Stelle auf DC-SIGN ist. Darüber hinaus wurden MD-Simulationen und ITC-Methoden angewendet, um die molekularen Grundlagen für die pH-abhängige Ca2+-Affinität von Langerin zu untersuchen. Wir weisen darauf hin, dass der Spalt zwischen der kurzen und der langen Schleife einen pH-Sensor, H294, beherbergt, der die Ca2+-Affinität stört, indem er das H-Brücken-Netzwerk zwischen den Schleifen bei der Protonierung beeinflusst. Interessanterweise ist dieser Spalt zwischen den kurzen und langen Schleifen nicht nur eine allosterische Stelle für kleine Moleküle, sondern beinhaltet auch ein allosterisches Netzwerk, das mit der Ca2+-Bindung verbunden ist. Zusammengenommen bietet die Identifizierung allosterischer Stellen und Modulatoren einen wertvollen Ausgangspunkt für die weitere Optimierung und Entwicklung neuer CTL-Inhibitoren.
Abstract
(Englisch)
The C-type lectins (CTLs) are pattern-recognition receptors (PRRs) that recognize a variety of ligands and regulate various physiological processes. In our body, CTLs distinguish between self and non-self and mediate immune response by recognizing and responding to invasive pathogens. Therefore, CTLs play important roles in pathogen recognition and innate immunity. The development of agonists or antagonists targeting CTLs is a potential approach for immunomodulatory therapeutics. However, due to the low druggability in carbohydrate binding sites (CBS), limited numbers of chemical probes or drug-like ligands have been developed against for CTLs. Recent studies show that allosteric modulators are highly specific due to low evolutionary pressure. Consequently, the main goal of this thesis is to identify allosteric sites and modulators targeting against CTLs DC-SIGN and Langerin. In this study, 61 fragments based on a 4-quinolone scaffold were synthesized and screened against DC-SIGN by using an STD reporter assay. Binding affinities were validated by using protein based 1H–15N HSQC NMR. Finally, based on the structure-activity relationship (SAR) study, we demonstrate that ethoxycarbonyl or dimethylaminocarbonyl at positions 2 or 3 enhance the binding activity of DC-SIGN, especially when combined with fluorine, ethoxycarbonyl, or dimethylaminocarbonyl at positions 7 or 8. The use of 19F reporter displacement assay (RDA) NMR has further suggested that these quinolones can allosterically modulate the CBS, thereby providing an alternative approach toward this challenging target protein. To identify the allosteric binding site of previously screened thiazolopyrimidines for Langerin, our research began with the hypothesis that the non-conserved short loop between human Langerin (hLang) and murine Langerin (mLang) is responsible for determining binding specificities between two homologs. Based on the structural comparison and MD simulations, the non-conserved short loops exhibit a high degree of conformational flexibility between the hLang and mLang homologs. Furthermore, mutational studies and sequence analysis revealed that a pair of residues is critical for determining the binding specificity of thiazolopyrimidines in different Langerin species. By combining solvent paramagnetic relaxation enhancement (sPRE) NMR studies with peptides binding studies, we were able to define that the cleft between the short and long loops forms the allosteric binding site for these aromatic heterocycles. To identify the allosteric site of DC-SIGN, we designed and synthesized a mutation M270F based on MD simulations. By using protein based 1H–15N HSQC NMR, we could confirm that the pocket between α-helix 2 and β sheet 0 and 1 is a secondary site on DC-SIGN. In addition, MD simulations and ITC methods were applied to explore the molecular basis for the pH-dependent Ca2+ affinity of Langerin. We indicate that the cleft between the short and long loop harbours a pH sensor, H294, which perturbs the Ca2+ affinity by affecting the H-bond network between the loops upon protonation. Interestingly, this cleft between the short and long loops is not only an allosteric site for small molecules, but also involves an allosteric network associated with Ca2+ binding. Taken together, identifying allosteric sites and modulators provides a valuable starting point for further optimization and development of new CTLs inhibitors.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
C-Typ-Lektine DC-SIGN Langerin allosterische Modulatoren allosterische Bindungsstelle
Schlagwörter
(Englisch)
C-type lectins DC-SIGN Langerin allosteric modulators allosteric binding site
Autor*innen
Hengxi Zhang
Haupttitel (Englisch)
Identification of allosteric modulators and investigations into the allosteric mechanism of the C-type lectins DC-SIGN and langerin
Paralleltitel (Deutsch)
Identifizierung von allosterischen Modulatoren und Untersuchungen zum allosterischen Mechanismus der C-Typ-Lektine DC-SIGN und Langerin
Publikationsjahr
2022
Umfangsangabe
X, 168 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Franck Fieschi ,
Jonathan Cramer
Klassifikationen
35 Chemie > 35.70 Biochemie: Allgemeines ,
44 Medizin > 44.40 Pharmazie, Pharmazeutika
AC Nummer
AC16685152
Utheses ID
64769
Studienkennzahl
UA | 796 | 610 | 449 |