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Optimising EGFR reporter transfections for studying tyrosine kinase inhibitors
Marián Péteri
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Drug Discovery and Development
Betreuer*in
Manfred Ogris
Mitbetreuer*in
Haider Sami
DOI
10.25365/thesis.72722
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-22107.22935.615243-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der epidermale Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) spielt eine Schlüsselrolle bei der Entstehung vieler epithelialer Krebsarten und ist daher ein intensiv untersuchtes Ziel für die Medikamentenentwicklung. Ziel dieser Arbeit war es, ein Transfektionsprotokoll für das EGFR-EGFP-Plasmidkonstrukt (kodierend für ein Fusionsprotein aus Grün fluoreszierendem Protein (EGFP) und EGFR) mit linearem Polyethylenimin als Transfektionsreagens zu optimieren, um eine maximale Transfektionseffizienz mit diesen Polyplexen bei minimaler Toxizität zu erreichen. Darüber hinaus wurde ein EGFR-EGFP Plasmid codierend für die die T790M-Mutante von EGFR in E.coli Bakterien expandiert und aufgereinigt, um in weiteren Experimenten nach Transfektion die Auswirkungen pharmakologischer Interventionen zwischen Wildtyp EGFR und mutiertem EGFR im Western-Blot-Experiment zu vergleichen. Ebenso wurde die Western Blot Methode entsprechend optimiert. Die Ergebnisse zeigten, dass die humane Zellinie HEK293T-Zellen bei Verwendung von 8 μg Plasmid DNA/well Transfektionsraten von bis zu 50 % ergaben. Die Toxizität der Polyplex-Transfektion war niedrig, da nach der Behandlung mit der höchsten Dosis noch etwa 84 % lebende Zellen vorhanden waren. Das T790M EGFR-EGFP Plasmid wurde in E.Coli expandiert und in der Transfektion validiert. Ein T790M EGFR-EGFP-Plasmid Klon wurde isoliert und expandiert, der sich hinsichtlich der Transfektionseffizienz wie sein Wildtyp-Gegenstück verhielt. Das Vorhandensein der Mutation wurde nach der Behandlung mit Tyrosinkinase-Inhibitoren in einem optimierten Western Blot validiert. Hier wurde eine deutliche EGFR-Aktivierung mit 0,1 ng/mL hEGF-Stimulation für 10 Minuten erreicht, und die Reduzierung der Dauer der Hitzebehandlung bei der Probenvorbereitung auf fünf Minuten führte zu besser abgegrenzten Proteinbanden im Western Blot. Außerdem reichten dann höhere Antikörperverdünnungen aus, um ein gutes Signal zu erzielen.
Abstract
(Englisch)
Epidermal growth factor receptor (EGFR) is a key player in development of many epithelial cancers, which made it a heavily studied drug target. The aim of this thesis was to optimise the transfection protocol with EGFR-EGFP plasmid construct (encoding a green fluorescent protein, EGFP, and EGFR fusion protein) using linear polyethylenimine as the transfection reagent to reach best transfection efficiency with these polyplexes with minimal toxicity. Moreover, T790M mutant of EGFR-EGFP in E. coli bacteria was expanded and purified to compare the effects of pharmacological intervention between wild type and mutant EGFR in western blot experiment, which was also optimised in the process. The results revealed the human cell line HEK293T as the most easily transfectable, with transfection efficiencies reaching up to ~ 50% following treatment with 8 μg per well treatment. Moreover, the toxicity of the polyplex transfection was low as there were still ~ 84% live cell after treatment with highest dose. The T790M EGFR-EGFP was expanded in E.coli and validated in transfection. This yielded one T790M EGFR-EGFP plasmid clone that behaved as its wild-type counterpart in terms of transfection efficiency. The presence of the mutation was validated in optimised western blot after tyrosine kinase inhibitors treatment. Here, good EGFR activation was achieved with 0.1 ng/mL hEGF stimulation for 10 minutes and reducing the heat treatment time in sample preparation to 5 minutes resulted in better defined protein bands. Furthermore, higher antibody dilutions were sufficient in achieving good signal.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
EGFR Tyrosinkinase-Inhibitoren Transfektionprotokoll
Schlagwörter
(Englisch)
EGFR Tyrosine kinase inhibitors Transfection protocol
Autor*innen
Marián Péteri
Haupttitel (Englisch)
Optimising EGFR reporter transfections for studying tyrosine kinase inhibitors
Paralleltitel (Deutsch)
Optimierung von EGFR-Reportertransfektionen zur Untersuchung von Tyrosinkinase-Inhibitoren
Publikationsjahr
2022
Umfangsangabe
105 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Manfred Ogris
AC Nummer
AC16693833
Utheses ID
65257
Studienkennzahl
UA | 066 | 606 | |