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The role of L-type voltage-gated calcium-channels in the discharge activity of primary hippocampal neurons
Michael Lagler
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Karlheinz Hilber
DOI
10.25365/thesis.7303
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29261.44751.791066-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
L-type spannungsabhängige Ca2+-Kanäle (LTCC) erfüllen verschiedene Aufgaben in erregbaren Zellen. Unter anderem wurde gezeigt, dass LTCCs zur Erregungs-Transkription Kopplung betragen [Pinato et al. 2009, West et al. 2002]. Darüberhinaus hat die Aktivierung von LTCCs sowohl einen direkten, als auch indirekten Einfluss auf die Membranspannung. Letzteres erfolgt z.B. über die Aktivierung von Ca2+-abhängigen K+- ]Lima and Marion 2007] und Kationen-Kanäle [Lee and Tepper 2007].
Im Zuge dieser Diplomarbeit wurde der Einfluss von LTCCs auf das Entladungsverhalten von hippocampalen Neuronen in vitro untersucht. Um das Membranpotential abzuleiten wurden „current clamp“-Experimente in der „perforated patch“-Konfiguration durchgeführt. ILTCC wurde durch die Applikation von den Dihydropyridine BayK 8644 (Agonist) und isradipine (Antagonist) verstärkt bzw. verringert. Um spannungsaktivierte Na+-Kanäle zu blockieren, deren Ströme die LTCC-induzierten Effekte überlagern würden, wurde bei allen „current clamp“-Experimenten TTX 500 nM zusätzlich appliziert. Die spanngungsinduzierte Aktivierung der LTCCs erfolgte mittels 5 aufeinander folgender Strominjektionen ansteigender Stromstärke, die entweder eine Rechteck- oder Rampenform aufwiesen. Das Ziel dieser Experimente war es (I) den Schwellenwert der LTCC-Aktivierung zu bestimmen und (II) die LTCC-induzierte Kopplung zu Ca2+-aktivierten Ionenkanälen zu untersuchen.
Die Analyse der Aktivierungschwelle des L-type Ca2+-Kanals ergab eine Population von Neuronen, deren Schwellenwerte größtenteils deutlich negativer als -35 mV lagen. Da bis dato keine neuronalen Cav1.2-Kanalvarinaten beschrieben worden sind, die negativer als -35 mV aktivieren würden, verweisen meine Daten auf einen bedeutenden Beitrag von Cav1.3-Kanälen, deren Aktivierung allgemein um 10 - 15 mV negativer liegt als die der Cav1.2-Kanäle. Dieses Ergebnis steht im krassen Gegensatz zu Untersuchungen an transgenen Tieren, deren Daten auf eine untergeordnete Rolle von Cav1.3-Kanälen im ZNS verwiesen [Clark et al. 2003, Lacinova et al. 2008, Moosmang et al. 2005].
Nachpotentiale traten in meinen Ergebnissen in zwei unterschiedlichen Modalitäten auf: Nachhyperpolarisationen (AHPs) und Nachdepolarisationen (ADPs). Diesen wurden typischerweise schon unter Kontrollbedingungen (DMSO) ausgelöst und durch ILTCC-Erhöhung mit BayK noch weiter verstärkt. Im Falle von 8 s andauernden depolarisierenden Strompulsen, überwiegte die Häufigkeit der AHPs klar. Aus pharmakologischer Sicht, konnten die AHPs als Apamin- und UCL 1684-sensitive und somit K(Ca)2.x/SK-vermittelt charakterisiert werden. Mittels Blockade von SK-Kanäle konnten zwei unterschiedliche AHP-Typen ausgemacht werden. Dies betraf das gleichzeitige Auftreten von AHPs und ADPs, was nur in einer Teilpopulation von hippocampalen Neuronen (50 %) nachgewiesen wurde (N = 5, Nachpotentialsfläche normalisiert auf DMSO mit BayK: -3.25, 8.05 oder BayK + apamin: 18.99, 22.72, p < 0.01). In der anderen Hälfte von Neuronen führte SK-Blockade lediglich zu einer Reduktion des AHPs (N = 10, Nachpotentialsfläche normalisiert auf DMSO mit BayK: -1.37, 1.30 oder BayK + apamin: 0.11, 1.00, p < 0.001). Mit Hilfe einer Außenlösung mit stark reduzierter [Na+] zusammen mit Isradipine konnte nachgewiesen werden, dass es sich bei IADP um einen Ca2+-aktivierten Na+-leitenden Ionenkanal handelt (N = 7, Nachpotentialsfläche normalisiert auf DMSO mit BayK + apamin = 2.22, 3.99 oder low Na+/BayK + apamin = 0.34, 0.68, p < 0.01, alle Werte sind dargestellt als Median und dem Interquartilabstand). Nach der Identifizierung der zugrunde liegenden Kanäle wurden die LTCC-induzieren Nachpotentiale in Abhängigkeit von der Stimulusintensität untersucht. Zu diesem Zweck wurden sowohl Pulslängen, als auch -stärken variiert. Daraus resultierende Ergebnisse weisen darauf hin, dass es zwischen SK- und CAN-Kanälen Unterschied in der Kopplungseffizienz gibt. Im Speziellen wurden ADPs bei kürzeren Pulsen (< 500 ms) ausgelöst, wogegen AHPs erst bei langanhaltenden Pulse (> 2 s) entstanden.
Anschließend wurde die Validität des Kopplungs-Modells im Bezug auf die physiologische Feueraktivität von Hippocampus-Neuronen getestet. Da das Entladungsverhalten von hippocampalen Neuronen in der Regel aus eher kurzen Depolarisationen (< 1 s) besteht, würde man anhand des Kopplungsmodells für diese Neurone eine stärkere LTCC-CAN- als LTCC-SK-Kopplung erwarten. Diese Vorhersage stimmte in der Tat mit den experimentellen Beobachtungen in unserer Kultur überein, indem 80 % der Neurone mit BayK ihre Feueraktivität verstärkten.
Daraus schlussfolgere ich, dass die funktionale Kopplung von L-type Ca2+-Kanälen an ADP-bildende CAN-Kanäle sowie AHP-bildende SK-Kanäle einen wichtigen Mechanismus zur Regulation hippocamplar Entladungsaktivität darstellt. Etwaige physiologische Implikationen sind im Falle der ADPs die Verstärkung von unterschwelligen Potentialen und im Falle der AHPs ein negativer Rückkopplungsmechanismus zur Unterbindung excitoxischer Plateaupotentiale [Ping and Sheppard 1999]. Zusammenfassend weisen meine Ergebnisse darauf hin, dass in primären hippocampalen Neuronen sowohl Cav1.2, als auch Cav1.3 aktiv sind und zeigen, dass (I) SK- und CAN-Kanäle funktional an L-type Ca2+-Kanäle koppeln, dass (II) in den meisten getesteten Neuronen eine Überlagerung beider Nachpotential-Modalitäten stattfindet und dass (III) sich diese beiden Nachpotentiale in der Effizienz der LTCC-Kopplung unterscheiden.
Abstract
(Englisch)
L-type voltage-gated calcium channels (LTCCs) were shown to have several distinct roles in excitable cells. For example, Ca2+-influx via LTCCs was shown to be an important component of the excitation-transcription coupling [West et al. 2002; Pinato et al. 2009]. Additionally, LTCC-mediated Ca2+-influx can also affect membrane voltage and discharge properties, either directly or via activation of Ca2+-dependent conductances, such as K+- [Lima and Marrion 2007], or cation-channels [Lee and Tepper 2007].
Here I evaluated the contribution of LTCCs to the electrical activity of central neurons in vitro. Current-clamp experiments were performed on hippocampal neurons in culture using the perforated patch-clamp method to record the membrane voltage. The neurons were continuously superfused and LTCC-activity was modulated by application of the dihydropyridines BayK 8644 3 µM (enhanced LTCC-activity) and isradipine 3 µM (LTCC-inhibition), all in the presence of TTX. Activation of LTCCs was provoked by incremental current injections to depolarize the neurons experimentally. Doing so, LTCC-activation thresholds and LTCC-induced afterpotentials, occurring after the current pulse, were investigated.
Analysis of LTCC-activation revealed a distinct population of neurons with thresholds negative to -35 mV under control conditions. Since neuronal Cav1.2-channel variations have never been found to activate at such negative potentials, these data argue for an important role of Cav1.3-channels in hippocampal neurons. This findings stand in clear contrast to what has previously been concluded from results obtained with transgenic mice [Clark et al. 2003; Moosmang et al. 2005; Lacinova et al. 2008].
The afterpotential occurring as after-hyperpolarizations (AHPs) or after-depolarizations (ADPs) were typically seen already under control conditions, and increased with BayK. Using 8 s-long current pulses, in the majority (80 %) of neurons, the afterpotential was an AHP, which could be blocked by apamin 100 nM or UCL 1684 30 nM indicating the involvement of K(Ca)2.x/SK-channels. K(Ca)2.x-blockade also revealed that the hyperpolarizing afterpotential can either represent a pure AHP (N = 10, afterpotential-area normalized to control under BayK: -1.37, 1.30 or BayK + apamin: 0.11, 1.00, p < 0.001) or an overlap of an AHP and ADP (N = 5, afterpotential-area normalized to control under BayK: -3.25, 8.05 or BayK + apamin: 18.99, 22.72, p < 0.01). In neurons, which showed a depolarizing afterpotential, the co-application of BayK and apamin as compared to BayK alone revealed a further enhancement of the ADP and therefore a concomitantly occurring AHP. Reduction of external [Na+] to 1.5 mM led to a significant diminishment of the ADP-area, suggesting that a Ca2+-activated non selective cation (CAN) channel mediates the primary excitatory LTCC-coupling in the hippocampus (N = 7, afterpotential-area normalized to DMSO under BayK + apamin = 2.22, 3.99 or low Na+/BayK + apamin = 0.34, 0.68, p < 0.01, all values are given as median and interquartile range).
Moreover, variations of the current pulse duration (0.1 to 10 s) as well as the pulse strength indicated that LTCC-coupling to CAN- and SK-channels differs in its coupling efficiency: CAN-channels activate at weaker stimuli (shorter and/or smaller depolarization) than SK-channels and long-lasting (> 2 s) favored the SK-mediated AHP-formation. As the control discharge pattern of hippocampal neurons mainly consists of rather short-lasting (500 ms to 1 s) depolarizations, the predominant abundance of cells increasing their excitation, when ILTCC is enhanced, is in accordance with the coupling-model described above.
From that, I suggest a certain balance between de- and hyperpolarizing LTCC-couplings as an important mechanism regulating the discharge activity in the hippocampus. This could include a CAN-mediated enhancement of short subthreshold potentials, such as in LTCC-dependent and NMDA-independent hippocampal LTP [Moosmang et al. 2005] as well as a SK-mediated protection against long-lasting excitotoxic LTCC-mediated plateau potentials occurring after SK-channels blockade [Ping et al. 1999]. In accordance with the latter assumption, the up-regulation of ICAN is currently discussed in relation to Parkinson’s desease [Lee and Tepper 2007].
To sum up, my data indicate that Cav1.2 as well as Cav1.3 contribute to hippocampal firing activities and suggest that in primary hippocampal neurons (I) LTCCs couple to both SK- and CAN-channels, (II) that in most hippocampal neurons both coupling modes operate in parallel and (III) that coupling efficiency differs among the two Ca2+-dependent conductances.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
neuroscience pharmacology
Schlagwörter
(Deutsch)
Neurowissenschaften Pharmakologie
Autor*innen
Michael Lagler
Haupttitel (Englisch)
The role of L-type voltage-gated calcium-channels in the discharge activity of primary hippocampal neurons
Paralleltitel (Deutsch)
Die Rolle von Spannungsgesteuerten Calcium-Kanälen im Entladungsverhalten von Primären Hippocampalen Neuronen
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
106 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Karlheinz Hilber
AC Nummer
AC08161318
Utheses ID
6618
Studienkennzahl
UA | 439 | | |