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The potential of CRISPR/Cas systems in treatment of Adenovirus infection
Florian Reithofer
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium NAWI Bereich Lebenswissenschaften (DissG: Biologie)
Betreuer*innen
Angela Witte ,
Reinhard Klein
DOI
10.25365/thesis.81055
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-10456.78818.695326-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Humane Adenoviren sind pathogene unbehüllte lineare Doppelstrang-DNA-Viren. Für die Mehrheit
der Bevölkerung stellt das Virus kein relevantes Risiko dar, da ein kompetentes Immunsystem eine
Infektion erfolgreich bekämpfen kann. Dies geht in der Regel mit einer lebenslangen Immunität
einher. Bei immungeschwächten Patienten oder in dicht besiedelten Gebieten, stellen Infektionen
jedoch eine große Herausforderung dar. Das Risiko einer disseminierten Krankheit, die den ganzen
Körper befällt, ist hoch, ebenso wie die gemeldeten Sterblichkeitsraten. Die verfügbaren
Behandlungsmöglichkeiten sind begrenzt und unbefriedigend. Daher ist die Suche nach neuen
Behandlungsmöglichkeiten eine klare medizinische Notwendigkeit. In den letzten Jahren sind RNAiund
CRISPR/Cas-basierte Methoden als antivirale Behandlungsplattformen zunehmend ins
Rampenlicht gerückt. Während die Forschung zu einem großen Teil präklinischer Natur ist, zeigen die
verfügbaren Daten aus klinischen Studien den Fortschritt auf dem Weg zum Patienten.
In dieser Arbeit habe ich die Anwendung von CRISPR/Cas-basierten Methoden und deren Kombination
mit RNAi zur Behandlung von Adenovirus-Infektionen untersucht. Ich konzentriere mich zunächst auf
den RNA-Targeting-Effektor CasRx. Wir haben eine optimierte antivirale Plattform entwickelt, die über
rekombinante adenovirale Vektoren in Zellen eingebracht wird und dort die Replikation des humanen
Adenovirus (HAdV-5) hemmt. In Assays wurden Inhibierungsraten von bis zu 2 Zehnerpotenzen
erreicht. Im zweiten Thema untersuche ich verschiedene Möglichkeiten, RNAi und CRISPR/CasRx zu
kombinieren, indem ich mehrere Plasmide generiere, die jeweils einen möglichen Weg des
Multiplexings verfolgen. Die beiden primären Optionen sind die Expression von artificial micro RNAs
unter demselben Promotor wie die gRNA oder aber zusammen mit CasRx. Die Daten zeigen, dass die
Verwendung eines prozessierten gRNA-Designs im ersten Fall die bessere Wahl zu sein scheint und im
zweiten Fall ein Design, das stabilisierenden mRNA-Strukturen ergänzt, welche durch RNAi
Prozessierung verlorengegangen sind.
Im dritten Thema konzentriere ich mich auf das DNA-Targeting Enzym Cas9. Ähnlich wie im ersten Teil
haben wir ein optimiertes antivirales System entwickelt, um die Replikation von Adenoviren in vitro zu
hemmen. Hier werden Inhibierungsraten von bis zu zwei Zehnerpotenzen bei Verwendung einer
einzelnen gRNA und bis zu drei Zehnerpotenzen bei Verwendung von Cidofovir in Kombination oder
einem Vektor, der vier gRNAs exprimiert, erreicht. Es wird auch gezeigt, wie die Expressions-
Kassettengröße durch Multiplexing mit artificial micro RNAs optimiert werden kann. Darüber hinaus
wurde HAdV-5-DNA aus Zellen isoliert, welche mit dem rekombinanten 4-fach gRNA-Konstrukt transduziert wurden. In mehr als 80% der viralen Genome wurden in der Sequenzierung Mutationen
entdeckt.
Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse das vielversprechende Potenzial von CRISPR/CasRx und
CRISPR/Cas9, allein oder in Kombination mit RNAi oder gleichzeitiger Medikation, gegen Adenovirus-
Infektionen und das Potential als Mittel der antiviralen Abwehr im Allgemeinen.
Abstract
(Englisch)
Human adenoviruses are pathogenic non-enveloped linear double-stranded DNA viruses. In the
majority of the population, the virus does not pose a relevant risk, as a competent immune system can
successfully fight and clear up an infection. This usually goes hand in hand with a lifelong immunity. In
immunocompromised patients or in closely packed environments however, infections pose a
significant challenge. The risk of a disseminated disease, affecting the whole body, is high and so are
reported mortality rates. Available treatment options are limited and unsatisfactory. Therefore, the
search for new treatment options is a clear medical need. In recent years, RNAi and CRISPR/Cas based
methods have increasingly moved into the spotlight as antiviral treatment platforms. While research is
mostly pre-clinical, available clinical trial data highlights the process that has been made towards the
patient.
In this thesis I investigated the application of CRISPR/Cas based methods and their combination with
RNAi to treat adenovirus infection. Herein I first focus on the RNA targeting effector CasRx. We
developed an optimized antiviral platform, delivered to cells by recombinant adenoviral vectors, which
targets human adenovirus (HAdV-5) replication in vitro. In assays, inhibition rates of up to 2 orders of
magnitude were achieved. In the second topic I explore different ways of combining RNAi and
CRISPR/CasRx, generating multiple plasmids, each following a different approach of multiplexing. The
two main options addressed are expression of artificial micro RNAs under the same promoter as the
gRNA or together with CasRx. The data showed that using a processed direct repeat gRNA design
seems to be the better choice in the former and a design supplementing lost stabilizing mRNA
structures due to artificial micro RNA processing in the latter.
In the third topic I focus on DNA targeting Cas9. Similar to the former part, we developed an optimized
antiviral system to target adenoviral replication in vitro. Here, inhibition rates of up 2 orders of
magnitude using a single gRNA and up to three orders of magnitude, when using cidofovir in
combination or a vector expressing four gRNAs, were achieved. It was also shown how to optimize
cassette size by multiplexing gRNAs with artificial micro RNAs. Furthermore, sequencing of isolated
HAdV-5 DNA from cells, transduced with the recombinant 4 times gRNA construct, showed mutations
in more than 80% of viral genomes.
Summarized, these results demonstrate the promising potential of CRISPR/CasRx and CRISPR/Cas9,
alone or in combination with RNAi or concurrent medication, against adenovirus infection and their
application as means of antiviral defense in general.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
CRISPR Cas CasRx Cas9 Cas13d Adenovirus Virus antiviral Infektion
Schlagwörter
(Englisch)
CRISPR Cas CasRx Cas9 Cas13d Adenovirus virus antiviral infection
Autor*innen
Florian Reithofer
Haupttitel (Englisch)
The potential of CRISPR/Cas systems in treatment of Adenovirus infection
Publikationsjahr
2023
Umfangsangabe
vi, 3-177 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Dorothee von Laer ,
Jürgen Neesen
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein. Allgemeines
AC Nummer
AC16861346
Utheses ID
66209
Studienkennzahl
UA | 794 | 685 | 437 |