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Deciphering the role of K412 acetylation on HDAC1 function
Selina Knörzer
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Genetik und Entwicklungsbiologie
Betreuer*in
Christian Seiser
DOI
10.25365/thesis.73445
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-18657.92776.529652-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Histondeacetylasen (HDACs) entfernen Acetyl-Gruppen von acetyliertem Lysin an Histoproteinen und führen dadurch zu einer kompakteren Chromatinstruktur und somit zu einer verringerten Genexpression. Obwohl HDACs zuerst als Enzyme klassifiziert wurden, die Histone deacetylieren, weiß man in der Zwischenzeit, dass sie auch für die Deacetylierung von Nicht-histon-Proteinen verantwortlich sind. Wir haben vor kurzem in der humanen Tumorzelllinie HAP1 gezeigt, dass die Klasse I Deacetylase HDAC1 selbst an spezifischen Lysin Resten acetyliert wird. Mit Hilfe von Massenspektrometrie wurden neun Lysin-Reste des HDAC1-Proteins identifiziert, die Ziel von Acetylierung sind. Interessanterweise lag einer der Lysine Reste, K412, in hyper-acetylierter Form vor, wenn die Zellen mit dem Klasse I HDAC-Inhibitor MS275 behandelt wurden. An katalytisch inaktivem HDAC1 liegt derselbe Lysin-Rest ebenfalls hyper-acetyliert vor. Dies deutet darauf hin, dass HDAC1 selbst ein Nicht-histon-Substrat für HDAC1 ist und somit potenziell eine Autodeacetlyierungsfunktion hat. Diese Daten wurden kürzlich auch in T-Zellen bestätigt (T. Vcelkova und W. Reiter). In diesem Projekt wollten wir untersuchen, ob die Acetylierung von HDAC1 an K412 eine biologische Funktion hat. Wir haben ihren Einfluss auf die enzymatische Aktivität, die Proteinstabilität und die Interaktion von HDAC1 mit anderen Proteinen untersucht. Die katalytische Aktivität blieb nach Mutation von HDAC1 zu acetylierungs-imitierenden (K412Q) oder acetylierungs-resistenten (K412R) Isoformen unverändert. Desgleichen hatte die Mutation von K412 keinen Einfluss auf die HDAC1-Proteinstabilität. Immunpräzipitationsexperimente deuteten jedoch darauf hin, dass die Bindungsaffinität von HDAC1 zu seinen Partner-Proteinen SIN3A und HDAC2 bei der acetylierungs-resistenten Mutante (K412R) verringert ist. Die Massenspektrometrie-Analyse des HDAC1-Interaktoms zeigte auch eine Tendenz zu einer reduzierten Wechselwirkung von HDAC2 mit der K412R-Mutante im Vergleich zu HDAC1 WT. HDAC2-Koimmunpräzipitationsstudien konnten diese Ergebnisse erneut bestätigen, während für SIN3A keine reduzierte Wechselwirkung mit der K412R Mutante festgestellt werden konnte. Zusammen gefasst verändert Mutation von Lysin 412 hauptsächlich das Interaktom aber nicht die katalytische Aktivität oder Stabilität des HDAC1-Enzyms. Schließlich haben wir in Zusammenarbeit mit der MPL Monoklonalen Antikörper Facility einen monoklonalen Maus-Antikörper, der acetyliertes Lysine 412 an HDAC1 erkennt, erzeugt. Die Präsenz sowie die Spezifität des Antikörpers wurden mit Hilfe von Acetyl-Lysin-Immunpräzipitaten von HDAC1 CI und HDAC1 CIK412R Zellen nachgewiesen. Der neue HDAC1 K412ac Antikörper wird für zukünftige Analysen der Funktion der dynamischen HDAC1 Acetylierung nützlich sein.
Abstract
(Englisch)
Histone deacetylases (HDACs) remove acetyl groups from acetylated lysine residues of histone proteins which results in a more compacted chromatin structure and thereby represses gene expression. Although, HDACs were initially discovered as enzymes that deacetylate histones, they have also been found to deacetylate non-histone proteins. We have recently shown that the class I deacetylase HDAC1 itself is acetylated in the human tumor cell line HAP1. Via mass spectrometry nine lysine residues on HDAC1 have been identified to be target of lysine acetylation. Interestingly, a specific lysine residue, K412, was hyperacetylated upon treatment with the class I HDAC inhibitor MS275 and on catalytically inactive HDAC1. This indicates that HDAC1 itself is a non-histone substrate of HDAC1 and has a potential auto-deacetylation function. These data were recently confirmed in murine T-cells (T. Vcelkova and W. Reiter). In this study we focused on deciphering the biological function of lysine 412 acetylation on HDAC1. We investigated the influence on its enzymatic activity, protein stability and interacting proteins. Catalytic deacetylase activity of HDAC1 was unaffected by acetylation mimicking (K412Q) and acetylation resistant (K412R) mutations. The mutation of K412 had also no effect on HDAC1 protein stability, which was followed via cycloheximide chase experiment. However, immunoprecipitation experiments suggest that the binding affinity of HDAC1 to its co-repressors SIN3A and HDAC2 is reduced in the acetylation resistant mutant (K412R). HDAC2 co-immunoprecipitation studies again confirmed these results, while we did not see a reduced interaction with the HDAC1 K412R mutant for SIN3A. Investigation of the interactome of HDAC1 via mass spectrometry also showed a trend to reduced interaction of HDAC2 with the K412R mutant in comparison to HDAC1 WT. In addition, proteins involved in DNA damage response showed an increased interaction with HDAC1 K412R. In summary, mutation of lysine 412 affects mostly the interactome of HDAC1 but not the activity or stability of the enzyme. Finally, we generated a monoclonal mouse antibody that recognizes acetylated K412 on HDAC1 in collaboration with the MPL Monoclonal Antibody facility. The presence and specificity of the antibody was verified on acetyl-lysine immunoprecipitates of HDAC1 CI and HDAC1 CIK412R. The novel HDAC1 K412ac antibody will be instrumental in future analyses of the function of dynamic HDAC1 acetylation.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Epigenetik Histon-Proteine Nicht-Histone Proteine Acetylierung
Schlagwörter
(Englisch)
Epigenetics Histones Acetylation Non-histone acetylation
Autor*innen
Selina Knörzer
Haupttitel (Englisch)
Deciphering the role of K412 acetylation on HDAC1 function
Paralleltitel (Deutsch)
Entschlüsselung der Rolle der K412-Acetylierung auf die HDAC1-Funktion
Publikationsjahr
2023
Umfangsangabe
63 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Christian Seiser
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften
AC Nummer
AC16838663
Utheses ID
66599
Studienkennzahl
UA | 066 | 877 | |