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Evaluation of a 3D cell culture method in radiobiology to reduce animal testing
Elma Joldic
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Pharmazie
Betreuer*in
Verena Pichler
DOI
10.25365/thesis.73439
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-23565.93367.740289-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Hintergrund: Präklinische Studien sind ein grundlegender Bestandteil der Arzneimittelforschung bis hin zur Arzneimittelzulassung. Hierbei liegt besonders die Ermittlung der Sicherheit und Unbedenklichkeit des Medikamentes im Vordergrund, um in weiterer Folge Klinische Studien am Menschen zu ermöglichen. Der Spheriograph, eine innovative 3D-Zellkulturmethode, bietet einen neuen Ansatz für In-vitro Experimente, wobei gewisse Eigenschaften eines lebenden Organismus nachgeahmt werden. Dadurch könnte die Anzahl an notwendigen Tierversuchen deutlich reduziert werden. Um dieses System jedoch als vollwertiges Diagnostikum zu implementieren, ist die Evaluierung mit verschiedenen bildgebenden Verfahren erforderlich. Ziel dieser Studie ist es, die Anwendbarkeit der Einzelphotonen-Emissionstomographie zu demonstrieren. In diesem Zusammenhang wurde die emittierten Photonen innerhalb eines 3D-Zellkultursystems, vor und nach der Bestrahlung, unter Verwendung von dem radioaktiv markierten Tracer [99mTc]MIBI, gemessen. Die erhaltenen Ergebnisse wurden mit Resultaten aus Zell-Viabilität-Assays verglichen. Methoden: Für die Präparation der 3D-Zellkultur wurden Schwämme aus Seide als Matrix verwendet und mit 100,000 Zellen/mL HT-29-Zellen bepflanzt. Der Spheriograph bestand aus einer Kunststoffsäule als äußere Halterung, die mit dem Seidengerüst gefüllt wurde, welches alle 1.1 Zentimeter durch Fritten unterteilt war. Für die Bestrahlung mit Photonen- und Protonenstrahlen wurde eine Halterung aus Polymethylmethacrylat hergestellt, dass eine identische und reproduzierbare Positionierung jeder getesteten Säule ermöglichte. Für die Bestrahlung wurden drei verschiedene Energiedosen im Bereich von 2 bis 8 Gy, mit dem Ziel einer linearen Steigerung der Effektivität, appliziert. Die Auswirkung wurde an drei aufeinanderfolgenden Tagen mit einem SPECT-Detektor gemessen. Abschließend wurde ein modifizierter MTT-Assay durchgeführt. Ergebnisse: Die Zellkonzentration von 100,000 Zellen/mL ermöglicht, dass 80 % Konfluenz innerhalb von sechs Tagen nach der Zellbepflanzung nicht überschritten werden. Die Protonenbestrahlung (Gruppe B) zeigte eine höhere Wirksamkeit im Vergleich zur Photonenbestrahlung (Gruppe A). Dies wurde deutlich, wenn man die [99mTc]MIBI-Aufnahmerate verglichen hat, wobei Gruppe B niedrigere Werte (75 %) erreichte als Gruppe A (80 %). Dies wurde ebenfalls durch die Ergebnisse des MTT-Assays bestärkt, die einen steileren Abfall der Zelllebensfähigkeit in Gruppe B zeigten. Zusätzlich wurde in beiden Gruppen eine gewisse Form der Zellregeneration beobachtet. Gruppe B zeigte jedoch eine stärkere Erholung, besonders wenn man die erhaltenen Werte 36 Stunden und 84 Stunden nach der Bestrahlung verglichen hat. Die untersuchten bildgebenden Verfahren wurden somit erfolgreich an das 3D-Zellkultursystem angepasst. Der verwendete Tracer [99mTc]MIBI zeigte jedoch eine unspezifische Bindung an die Seide, was die Analyse der Daten erschwerte. Für weitere Tests wird ein Austausch dieses spezifischen Tracers empfohlen. Schlussfolgerung: Das Spheriograph-System ist eine fortschrittliche und innovative Methode, die das Potenzial hat, Tierversuche zu reduzieren. Diese Studie erweitert die Anwendung von bildgebenden Verfahren und Zell-Viabilität-Assays und passt diese erfolgreich an das 3D-Zellkultursystem an.
Abstract
(Englisch)
Background: Preclinical trials are a fundamental part of drug discovery leading up to drug approval. Especially providing crucial information on the safety of the drug-candidate, subsequently enabling further testing on human subjects. The innovative Spheriograph 3D cell culture method offers a new and improved approach for in-vitro experiments representing in-vivo like characteristics, potentially reducing the need for animal trials. To fully implement this system as a diagnostic tool, evaluation of diverse imaging methods is needed. The aim of this study is to showcase the applicability of single photon emission tomography. In this regard photon annihilation within a 3D-culture system was evaluated pre- and post-irradiation, using the radiolabelled tracer [99mTc]MIBI. The respective results were compared to data received from cell viability assays to gain further confirmation. Methods: For the preparation of the 3D-cell culture, silk-fibroin sponges were used as the matrix and implanted with 100,000 cell/mL of HT-29 cells. Assembling the system, a plastic column was used as the exterior bracket, filling it with the silk scaffold which was divided by frits every 1.1 centimetres. For the photon and proton beam irradiation, an acrylic bracket was created out of polymethylmethacrylate, providing identical and replicable positioning of every tested column. For the irradiation three different energy doses were applied ranging from 2 to 8 Gy aiming for a linear increase of the effectiveness. The impact was measured for three subsequent days with a μSPECT detector. Lastly an MTT-assay was performed adapting the respective standard operating procedure. Results: Firstly, the ideal cell concentration not exceeding 80% confluency within six days after cell-plantation was determined at 100,000 cells/mL. Furthermore, proton beam irradiation (group B) showed a higher effectiveness compared to photon irradiation (group A). This was evident when comparing the [99mTc]MIBI uptake rate, reaching lower values of 75% in group B whereas group A stayed above 80%. This was further confirmed by the results from the MTT-assay showing a steeper decline in cell viability in group B. Additionally, some form of cell regeneration was observed in both groups. However, group B expressed a higher shift from 36 h to 84 h post-irradiation. Thus, confirming the successful adaptation of imaging methods to the 3D-cell-culture system. However, the used tracer [99mTc]MIBI experienced unspecific binding to the silk, complicating the analysis of the data. For further testing an exchange of this specific tracer is recommended. Conclusion: The Spheriograph system is an advanced and innovative method that has the potential to reduce animal testing. This study expanded the application and adaptation of imaging methods and cell viability assays to the 3D-cell culture system.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
3D Zellkultur Strahlungstherapie SPECT
Schlagwörter
(Englisch)
3D cell culture radiation therapy SPECT
Autor*innen
Elma Joldic
Haupttitel (Englisch)
Evaluation of a 3D cell culture method in radiobiology to reduce animal testing
Paralleltitel (Deutsch)
Evaluation einer 3D-Zellkulturmethode in der Strahlenbiologie zur Reduzierung von Tierversuchen
Publikationsjahr
2023
Umfangsangabe
vii, 42 Seiten
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Verena Pichler
AC Nummer
AC16831098
Utheses ID
66634
Studienkennzahl
UA | 066 | 605 | |