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Glycolipid profiling of colon cancer samples using liquid chromatography, high resolution mass spectrometry and multistage fragmentation
Richard Urban
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Chemie
Betreuer*in
Evelyn Rampler
DOI
10.25365/thesis.73637
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-15284.28531.677915-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Glykosphingolipide (GSL) sind eine wichtige bioaktive Lipidgruppe, die in vielen zellulären Prozessen mitwirken und als Biomarker für bestimmte Krankheiten gelten. Trotz ihrer Bedeutung in der Diagnostik und Forschung sind noch zahlreiche Funktionsfragen offen. Um bestimmte Fragestellungen zu beantworten und eine aussagekräftige Analyse von organischen Proben zu ermöglichen, bedient sich die Forschungsdisziplin Lipidomik der Flüssigchromatographie und der Massenspektrometrie. Durch die richtige Abstimmung der Methode auf die jeweilige Lipidklasse kann eine gewünschte Auftrennung und Charakterisierung gewährleistet werden. Das Ziel der Arbeit war es, eine Umkehrphasen-Flüssigchromatographie (RP-LC) und Massenspektrometrie Methode zum Nachweis und zur Deutung bestimmter Glykosphingolipid Klassen in einem GSL-Standardpool zu entwickeln, sowie die ausgewählten Lipide auf das Vorkommen in einer Darmkrebs Probe (HCT116) zu untersuchen. Insbesondere wurde auf drei GSL-Unterklassen: Lactosylceramide, Globoside (Gb3, Gb4, Globo-H) und Ganglioside (GM3) näher eingegangen. Zur Methodenvalidierung wurde Flüssigchromatographie mit hochauflösender Tandem-Massenspektrometrie gekoppelt und die Spektren auf MS1 und MS2 Level untersucht. Des Weiteren wurden mehrere HESI (erhitzte Elektrospray-Ionisierung) Parameter variiert und auf die Veränderungen auf MS1 Ebene überprüft. Die Identifizierung von Lipidfragmenten auf MS2 Level mit Freestyle154 ermöglichte die genaue Zuordnung von einzelnen Lipiden. Mithilfe von Skyline78 und einer „Target“-Liste konnte eine definierte Übersicht, der in den Proben enthaltenen GSL erstellt werden. Die Funktionsweise der Methode und die Trennung der GSL-Klassen wurden vorgestellt und ausführlich über Polarität, Retentionszeiten und analytische Grenzen diskutiert. Die neue Methode erwies sich als geeignet für die GSL-Analyse in komplexen Proben, die strukturelle Details bis hin zur Ebene der molekularen Lipidspezies offenlegt. Alle GSL-Klassen konnten durch RP-LC getrennt werden und es wurden hydroxylierte gesättigte langkettige Fettsäuren mit einer Kettenlänge von 38 Kohlenstoffatomen neben sehr kurzkettigen Fettsäuren mit 2 Kohlenstoffatomen, einschließlich ungerader FA-Ketten, nachgewiesen. Die Untersuchung der Darmkrebsprobe ergab über 50 Lipid-Spezies in unterschiedlichen Konzentrationen in jeder GSL-Klasse. Der entwickelte Arbeitsablauf war der erste Schritt hin zu einem umfassenden Assay für GSL-Klassen mittels RP-MS/MS und könnte zukünftig den Weg zu einem besseren Verständnis der GSL-Strukturen und ihres Auftretens bei Krebs ebnen.
Abstract
(Englisch)
Glycosphingolipids (GSLs) are an important bioactive lipid group involved in many cellular processes and considered biomarkers for certain diseases. Despite their importance in diagnostics and research, numerous functional questions remain unanswered. In order to answer these questions and facilitate meaningful analysis of organic samples, the research discipline lipidomics uses liquid chromatography coupled to mass spectrometry. Proper matching of the method to the respective lipid class ensures desired separation and characterization. The aim of this work was to develop a reversed-phase liquid chromatography and mass spectrometry method for the detection and interpretation of certain glycosphingolipid (GSL) classes in a GSL standard pool and to examine the selected lipids for their occurrence in a colon cancer sample (HCT116). In particular, three GSL subclasses were discussed: lactosylceramides, globosides (Gb3, Gb4, Globo-H) and gangliosides (GM3). For method validation, liquid chromatography was coupled with high-resolution tandem mass spectrometry and the spectra were recorded at the MS1 and MS2 levels. Furthermore, several electrospray ionization (ESI) source parameters were varied and checked for changes at the MS1 level for each lipid class. The identification of lipid fragments at the MS2 level with FreeStyle154 enables the precise assignment of individual lipids. With the help of a target list and Skyline78, an overview of the lipid species could be created. The functionality of the method and separation of the GSL classes were presented and discussed in detail about polarity, retention times and analytical limits. The new method proved to be fit for purpose for GSL analysis in complex samples revealing structural details up to the molecular lipid species level. All GSL classes could be separated by the reverse phase chromatography and hydroxylated saturated long-chain fatty acids with a chain length of 38 carbon atoms were detected alongside very short-chain fatty acids with 2 carbon atoms, including odd FA chains. The investigated colon cancer sample revealed over 50 species in different levels in each GSLs class. The developed workflow was the first step towards a comprehensive assay for GSL classes by RP-MS/MS and could pave the way to a better understanding of GSL structures and their occurrence in cancer.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Literaturrecherche Glykosphingolipid Analyse Humane Krebszellen Lipidomics Research Analysen Ultrahochdruckflüssigchromatographie UHPLC hochauflösende Massenspektrometrie HRMS MS1 Datenvalidierung MS2 Fragmentinformationen Methodenoptimierung Dateninterpretation Zusammenfassung Ergebnisse
Schlagwörter
(Englisch)
Literature review Glycosphingolipid analysis Human cancer cells Lipidomics research analyses Ultra-high pressure liquid chromatography UHPLC high resolution mass spectrometry HRMS MS1 data validation MS2 fragment information Method optimization Data interpretation Summary results
Autor*innen
Richard Urban
Haupttitel (Englisch)
Glycolipid profiling of colon cancer samples using liquid chromatography, high resolution mass spectrometry and multistage fragmentation
Paralleltitel (Deutsch)
Glykolipid-Profilierung von Dickdarmkrebs-Proben mittels Flüssig-Chromatographie, hochauflösender Massenspektrometrie und mehrstufiger Fragmentierung
Publikationsjahr
2023
Umfangsangabe
XII, 80 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Evelyn Rampler
AC Nummer
AC16867531
Utheses ID
67060
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |