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A novel system to quantify chromosomal proximity in vivo based on the phiC31 integrase
Maximilian Benesch
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Genetik und Entwicklungsbiologie
Betreuer*in
Franz Klein
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.73942
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-22916.28401.471282-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Spo11 induziert DNA-Schäden in Form von Doppelstrangbrüchen (DSBs), die für die meiotische Rekombination unerlässlich sind 1,2. Die enge Verwandtschaft zwischen dem meiotischen Spo11/TopVIBL-Komplex und dem archaebakteriellen TopoVI, das DNA-Kreuzungen auflöst, legt nahe, dass Spo11 auch an dsDNA-Kreuzungen schneidet. Zwei neuere Studien zeigen, dass Spo11 die DNA bei dessen Bindung verbiegen kann, was darauf hindeutet, dass Spo11 an seiner Bindungsstelle DNA-DNA Nähe als Voraussetzung für DSB-Bildung fördern könnte 3,4. In dieser Studie wollen wir ein System zur Messung von DNA-DNA Nähe in vivo etablieren, indem wir mit Hilfe der Serin-Integrase des Bakteriophagen φC31 (phiC31) Rekombinationen bei DNA-DNA Nähe katalysieren. Die vom Phagen kodierte Integrase (Int) erkennt und bindet spezifische DNA-Sequenzen, die als attachment sites (att) bezeichnet werden, und fördert eine unidirektionale Rekombinationsreaktion zwischen diesen Stellen 5. Wir präsentieren ein System, bestehend aus der φC31Int mit zugehörigen Regulationselementen und att sites in Kombination mit verschiedenen Quantifikationsverfahren. Wir haben Tandem-Att sites an zwei Positionen im Genom von S.Cerevisiae entwickelt, die den Nachweis von Rekombinationen zwischen Schwesterchromatiden durch unequal sister chromatid exchange ermöglichen. Ein ursprüngliches System, das auf Multiplex-PCR basierte, wurde später durch einen Satz spezifischer qPCR-Primer ersetzt, die eine lineare und hochempfindliche Quantifizierung der Rekombinationsprodukte über mehrere Größenordnungen ermöglichen. Die beiden Loci an denen diese att sites integriert wurden, befinden sich an charakteristisch unterschiedlichen Positionen, eine an einer konvergenten und eine an einer divergenten Transkriptionsstelle. Konvergente Transkription spezifiziert Cohesin-Bindungsstellen in der Chromosomen Core Region, während divergente Transkription ein Kennzeichen von Rekombinations-Hotspots in Loops von Chromosomen ist. Das induzierbare pGal1/Gal4-ER-Promotorsystem in Kombination mit dem induzierbaren pCup1-Promotor erlaubt rasche φC31Int Induktion ohne vorzeitiger Expression. Die Ergebnisse zeigen, dass diese Integrase äußerst effizient arbeitet. Die häufigen Interaktionen zwischen den Schwestern führen zu nahezu einer Rekombination pro Zelle und Zellzyklus, was mit unserem nicht-linearen mathematischen Modell übereinstimmt. Gegenwärtig ist die Induktion von φC31Int langsamer als Inter-Sister-Interaktionen (IS), so dass eine genaue Quantifizierung der IS-Interaktionsraten nur bedingt möglich ist, während seltenere Rekokbinationsereignisse gemessen warden können. Wir glauben, dass das System geeignet ist, um zu untersuchen, ob DNA-DNA-Näherungen mit Spo11-Aktivitäten in Verbindung stehen, dazu sind weitere Charakterisierungen des Systems jedoch notwenig.
Abstract
(Englisch)
Spo11 induces programmed DNA damage in the form of double-strand breaks (DSBs) which is essential to initiate meiotic recombination1,2. The close relation between the meiotic Spo11/TopVIBL complex with the archaebacterial TopoVI, which resolves DNA junctions, suggests that Spo11 cleaves also at dsDNA junctions. Two recent studies show that Spo11 can bend the DNA upon binding, suggesting that Spo11 might provoke DNA-DNA proximities at its binding site as a prerequisite for DSB formations3,4. In this study we aim to establish a system to measure DNA-DNA proximities in vivo by converting proximities to recombination events with the serine integrase of bacteriophage φC31 (phiC31). The phage encoded integrase (Int) recognizes and binds specific DNA sequences called attachment (att) sites and promotes a unidirectional recombination reaction between them5. Here we present a system to control the φC31Int in combination with various read outs. We designed tandem att sites at two positions in the budding yeast genome, which enables the detection of inter-sister chromatid recombination through unequal sister chromatid exchange. An original system, based on multiplex PCR was later replaced by a set of specific qPCR primers, which provide linear and highly sensitive quantification of recombination products, over several orders of magnitude. The two loci at which these att sites were integrated are at distinctly different positions, one at a con- and one at a divergent transcription site. Convergent transcription specifies cohesin binding sites at the chromosome core, while divergent transcription is a hallmark of recombination hotspots at chromosome loop regions. We employed the pGal1/Gal4-ER inducible promoter system in conjunction with the pCup1 inducible promoter to regulate Gal4-ER expression to be able to induce φC31Int steeply without leakage. The results reveal that this integrase works extremely efficiently. Non-linear, mathematical modelling can explain the kinetics of detected exchanges, which are consistent with frequent inter-sister interactions close to once per cell and cell cycle. Because the modules are consumed by the recombination, it is only possible to detect one reaction. Currently, induction of φC31Int is slower than inter-sister (IS) interactions, therefore a precise relative assessment of IS interaction rates will require faster φC31Int activation. Rarer events can be measured. Nevertheless, we believe that the system is suited to ask whether DNA-DNA proximities are associated with Spo11 activities. Further characterization, such as characterizing the efficiency of intramolecular recombination between certain att sites in the meiotic context will be the next step.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Deutsch)
phiC31 Integrase Spo11 Chromosomale Nähe
Schlagwörter
(Englisch)
phiC31 integrase Spo11 chromosomal proximity
Autor*innen
Maximilian Benesch
Haupttitel (Englisch)
A novel system to quantify chromosomal proximity in vivo based on the phiC31 integrase
Paralleltitel (Deutsch)
Ein neues System um chromosomale Nähe mit Hilfe der phiC31 Integrase zu quantifizieren
Publikationsjahr
2023
Umfangsangabe
95 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Franz Klein
Klassifikation
42 Biologie > 42.20 Genetik
AC Nummer
AC16915059
Utheses ID
67169
Studienkennzahl
UA | 066 | 877 | |
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