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Genetic manipulation and recombinant protein expression in Histomonas meleagridi
Julia Loni Schellhammer
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Michael Hess
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Alle Rechte vorbehalten / All rights reserved
DOI
10.25365/thesis.74263
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-13686.58140.871649-4
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Abstracts

Abstract
(Deutsch)
Histomonas meleagridis, der Erreger der Schwarzkopfkrankheit beim Geflügel, ist ein einzelliger Parasit und bis zum jetzigen Zeitpunkt wurde noch keine Modifikation an seinem DNA -Material vorgenommen. Ziel dieser Arbeit war die Etablierung eines Transfektionsprotokolls zur Einführung fremder DNA in H. meleagridis-Zellen und damit die Schaffung einer Grundlage für zukünftige CRISPR/Cas 9-Modifikationen. Sechs verschiedene Plasmide, mit dem Reportergen für das grün fluoreszierende Protein (GFP), wurden entworfen und konstruiert. Insgesamt wurden drei verschiedene Promotor- und Terminator- Sequenzen und drei verschiedene GFP-Gene getestet. Für die Transfektion des Plasmids in die Parasitenzellen wurden drei verschiedene Verfahren getestet: (1) herkömmliche Elektroporation mit einem E. coli Pulser TM -Gerät; (2) Elektroporation mit dem Neon-Transfektionssystem; und (3) Lipofektion. Zur Überprüfung des Erfolges des Transformationsprotokolls, wurde ein Testsystem eingesetzt. Dieses System basierte auf der Detektion des GFP-Proteins in den Histomonas-Zellen mittels Fluoreszenzmikroskopie und Western-Blot-Analyse. Zusätzlich wurde eine spezifische PCR-Reaktion für das GFP-Gen durchgeführt, um festzustellen, ob das Plasmid in die Parasitenzelle gelangt war. Keines der Experimente führte zur Detektion des GFP-Proteins oder des GFP-Gens in den H. meleagridis-Zellen, was darauf hindeutet, dass die Transfektionsversuche nicht erfolgreich waren. Um die Wirksamkeit der angewandten Transfektionssysteme und Plasmidkostrukte zu bewerten, wurden Transfektionen in Trichomonas gallinae, einem weiteren aviären Protozoen, und in der hepatozellulären Karzinom-Zelllinie von männlichen Leghorn-Hühnern (LHM) durchgeführt. Doch nur die Kontroll-LMH-Zellen produzierten ein GFP-Signal, was die Probleme Protozoenzellen zu transfizieren unterstereicht. Basierend auf diesen Ergebnissen ist offensichtlich, dass weitere Variationen der Transfektionsprotokolle erforscht und bewertet werden müssen, bevor eine erfolgreiche genomische Manipulation von H. meleagridis erreicht werden kann.
Abstract
(Englisch)
The protozoan parasite Histomonas meleagridis is the causative agent of blackhead disease in poultry. Currently, no modifications have been made to its DNA. Therefore, the aim of this work was to establish a transfection protocol to introduce foreign DNA into H. meleagridis cells, laying the foundation for future CRISPR/Cas 9 modifications. Six different plasmids carrying the green fluorescent protein (GFP) reporter gene were designed and constructed. These plasmids included three different promoter or terminator sequences and three different GFP genes. Three different methods were tested to transfect the plasmids into parasite cells: (1) conventional electroporation with an E. coli Pulser™ device; (2) electroporation with the Neon Transfection System; and (3) lipofection. To assess the success of the transformation protocol, a read-out system was employed. This system involved detecting GFP protein in histomonad cells through fluorescence microscopy and Western blot analysis. In addition, a specific PCR reaction targeting the GFP gene was applied to determine whether the plasmid had entered the parasite cell. Unfortunately, none of the experiments yielded any detection of the GFP gene or GFP protein in H. meleagridis cells,suggesting that the transfection attempts were unsuccessful. To evaluate the effectiveness of the transfection systems and plasmid constructs, transfections were performed on Trichomonas gallinae, another avian protozoan parasite, another avian protozoan parasite, and on hepatocellular carcinoma cell line of male leghorn chicken (LMH). Only the LMH cells produced a GFP signal after transfection indicating a deficiency to establish transfections in protozoan parasites. Based on these results, it is obvious that further variations of transfection protocols need to be explored and evaluated before successful genomic manipulation of H. meleagridis can be achieved.

Schlagwörter

Schlagwörter
(Deutsch)
Histomonas meleagridis Crispr Cas 9 Transfektion
Schlagwörter
(Englisch)
Histomonas meleagridis Crispr Cas 9 transfection genetic manipulation
Autor*innen
Julia Loni Schellhammer
Haupttitel (Englisch)
Genetic manipulation and recombinant protein expression in Histomonas meleagridi
Paralleltitel (Deutsch)
Genetische Manipulation und rekombinante Proteine in Histomonas meleagridis
Publikationsjahr
2023
Umfangsangabe
68 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Michael Hess
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.20 Genetik ,
42 Biologie > 42.36 Parasitologie
AC Nummer
AC16945171
Utheses ID
67638
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |
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