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Outcome of treatment of human HPV-positive cervical cancer cells with selective inhibitors of CDKs
Andreea Ana-Maria Borza
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Jozefa Jozefa Gadek-Wesierski
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30130.98920.634163-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Anwendung von pharmakologischen Cyclin-abhängigen Kinase Inhibitoren ist eine ziemlich neue und vielversprechende therapeutische Strategie in der Bekämpfung von Krebs. Zwei Inhibitoren, die zur Gruppe der Purine Analoge zählen, nämlich Roscovitin (ROSC) und Olomoucin II (OLO II), scheinen von großer klinischer Bedeutung zu sein.
In dieser Diplomarbeit wurden die Effekte beider Inhibitoren auf zwei verschiedene huma-ne Zervix Karzinom Zelllinien im Detail untersucht. Zieht man die Tatsache in Betracht, dass ROSC und OLO II in ihrer Struktur sehr ähnlich sind – sie unterscheiden sich in nur einer Hydroxylgruppe voneinander – war es von Interesse ihre Wirkung auf humane HeLa und HTB-31 Zervix Krebszellen, die sich im p53 und G1/S Checkpoint Status unterschei-den, zu bestimmen und untereinander zu vergleichen. Die Frage kam auf, ob und wenn ja, in welchem Ausmaß beide Inhibitoren die zelluläre Proliferation, die Zellzyklusprogressi-on und den programmierten Zelltod beeinflussen würden. In HeLa Zellen sind beide Tu-morsuppressor Proteine, p53 und pRb, auf Grund einer HPV Infektion nicht funktionell, wobei in HTB-31 Zellen beide Tumorsuppressor Gene mutiert sind. In diesem Zusammen-hang tauchte die Frage auf, ob beide Inhibitoren im Stande sein würden die HPV-kodierten Proteine zu reprimieren und dadurch p53 zu reaktivieren und den Checkpoint in HeLa Zel-len wiederherzustellen.
Unsere Resultate zeigen die starken anti-proliferativen Effekte von ROSC und OLO II. Beide Inhibitoren reduzierten die Zahl der lebenden Zellen in einer Zeit- und Konzentrati-ons-abhängigen Art und Weise. Die Abnahme der Zellzahl ist auf die Induktion eines Zell-zyklusarrests und/oder Apoptose zurückzuführen. Das Ergebnis hängt jedoch stark von der Medikamentenkonzentration ab. ROSC in einer niedrigeren Dosierung (20 µM) induzierte einen G2/M Arrest, welcher in HTB-31 mit einiger Verzögerung auftrat. Höhere Konzent-rationen desselben Medikaments verursachten eine Caspase-abhängige Apoptose primär in HeLa Zellen, die durch die Aktivierung der Caspase-3 nachgewiesen wurde. Die Zunahme von Caspase-3 stand in Einklang mit den Veränderungen in der Balance zwischen pro- und anti-apoptotischen Faktoren: die erhöhte Expression des pro-apoptotischen Proteins Bad und die zeitgleiche Inaktivierung von Survivin. Im Gegensatz zu HeLa Zellen waren HTB-31 Zellen gegenüber der Wirkung von ROSC resistenter und apoptotische Zellen traten erst nach einer längeren Behandlungszeit auf (48h oder länger). Diese Beobachtungen sind nicht überraschend, da die p53 und pRb Tumorsuppressor Proteine mutiert sind und CDK Inhibitoren nicht fähig sind sie zu reaktivieren.
Interessanterweise war OLO II in beiden Zelllinien effizienter als ROSC, wobei es dieselbe Wirkung, allerdings bei niedrigeren Dosen, ausübte.
Weiters wurde die Bedeutung des Zustandes von Krebszellen vor dem Beginn der Behand-lung für den Ausgang der Therapie untersucht. Asynchron wachsende und synchronisierte Zellen wurden den Medikamenten ausgesetzt. Die Verabreichung der Medikamente wurde im Fall der asynchron wachsenden Zellen nach unterschiedlichen Zeitpunkten nach dem Ansetzen vorgenommen. Zellen, die eine kurze Erholungszeit (10h) hatten, wurden in der G1 Phase arretiert und betraten den aktiven Zellzyklus nach einer längeren Zeit (22h) nach dem Ansetzen. Interessanterweise waren Zellen nach einer kurzen Erholungszeit weniger empfindlich gegenüber den Medikamenten als Zellen nach 22h nach dem Ansetzen. Zu-sätzlich wurden synchronisierte Zellen, die aus dem Arrest entlassen wurden, verschiede-nen CDK Inhibitoren ausgesetzt. ROSC war im Stande den Zellzyklusarrest von synchro-nisierten HeLa Zellen in der frühen, nicht aber in der späten, G1 Phase zu verlängern.
Die Analyse der zellulären Proteine in Proben von unbehandelten und mit beiden CDK Inhibitoren behandelten Zellen über zunehmende Zeitspannen durch Immunoblots gaben Einsicht in die Mechanismen der ROSC und OLO II Wirkung.
Beide Inhibitoren unterdrückten die Aktivierung von CDK7 und waren dadurch im Stande die ortsspezifische Phosphorylierung der CTD der RNA Polymerase II zu hemmen. Daraus resultierte ein Block der allgemeinen Transkription. Der Zusammenbruch der Transkripti-on führte zur verminderten Expression der E6 und E7 onkogenen Proteine in HeLa Zellen. In unbehandelten HeLa Zellen binden und inaktivieren diese viral kodierten Proteine p53 beziehungsweise pRb und tragen dadurch zur malignen Transformation bei. Demzufolge stellte die Außerkraftsetzung von E6 und E7 den G1 Restrikionscheckpoint wieder her. Dies wurde durch die Reaktivierung des pRb Proteins und der starken Hochregulation von p53 nach einer ROSC Behandlung nachgewiesen. Die wiederhergestellte p53 Aktivität trägt zum Zellzyklusarrest und zur Apoptose bei und repräsentiert dabei ein weiterer Me-chanismus der ROSC Wirkung.
Im Gegensatz dazu wurden die p53 Mengen in HTB-31 Zellen nicht beeinflusst. Das weist daraufhin, dass die Hemmung von CDKs nicht ausreichend ist um dem mutierten Protein entgegenzuwirken. Zusätzlich zeigte die Synchronisierung von HeLa Zellen mit Trichosta-tin A, ein Deacetylase Inhibitor, vor der eigentlichen ROSC Behandlung die verbesserte Wirkung von ROSC im Vergleich zur Behandlung von nicht synchronisierten Zellen.
Insgesamt weisen ROSC und OLO II ein hohes therapeutisches Potential auf Grund ihrer erhöhten Selektivität gegenüber transformierten Zellen auf. Ihre Fähigkeit den Zellzyklus zu modulieren und zusätzlich einen kontrollierten Zelltod zu induzieren hängt mit ihrer relativ niedrigen, wenn überhaupt vorhandenen Zytotoxizität zusammen. Die geringe Zyto-toxizität von CDK Inhibitoren ist ein großer Vorteil ebendieser. Außerdem sind die plei-otropen Effekte, die von ROSC und OLO II ausgeübt werden, ebenfalls ein großer Vorteil.
Abstract
(Englisch)
The application of pharmacological small-molecule inhibitors of cyclin-dependent kinases is a quite new and promising therapeutical strategy in combating cancer. Two inhibitors belonging to the group of purine analogues, namely roscovitine (ROSC) and olomoucine II (OLO II) seem to be of great clinical importance.
In this diploma thesis the action of both inhibitors on two different human cervix carci-noma cell lines was analyzed in detail. Considering the fact that ROSC and OLO II are structurally closely related – they differ in only one hydroxyl group – it was of interest to assess and to compare their effects on human HeLa and HTB-31 cervical cancer cells dif-fering in the p53 and G1/S checkpoint status. The question was raised whether and if yes, to what extent they would affect cellular proliferation, cell cycle progression and pro-grammed cell death. In HeLa cells both tumor suppressor proteins, p53 and pRb, are not functional due to HPV infection, whereas in HTB-31 cells both tumor suppressor genes are mutated. In this context the issue appeared whether both inhibitors would be able to repress HPV-encoded proteins and in this way to reactivate p53 and restore the checkpoint in HeLa cells.
Our results demonstrated the high anti-proliferative effects of ROSC and OLO II. Both inhibitors reduced the numbers of living cells in a time- and concentration dependent man-ner. The reduction of cell numbers was attributable to induction of cell cycle arrest and/or apoptosis. However, the outcome strongly depends on drug concentration. ROSC at lower dosage (20 µM) induced a G2/M arrest that in HTB-31 cells appeared with some delay. Higher concentrations of the same drug induced caspase-dependent apoptosis primarily in HeLa cells, as evidenced by activation of caspase-3. The increase of caspase-3 coincided with changes in a balance between pro- and anti-apoptotic factors: the upregulation of the pro-apoptotic protein Bad and the concomitant inactivation of survivin. Unlike HeLa cells, HTB-31 cells were more resistant to ROSC action and apoptotic cells appeared after a longer treatment time (48h or longer). These observations are not surprising because p53 and pRb tumor suppressor proteins are mutated and CDK inhibitors are not able to reacti-vate them.
Interestingly, OLO II was more efficient than ROSC in both cell lines, exerting exactly the same effects, however at lower doses.
Moreover, the importance of the status of cancer cells prior to the onset of treatment for the outcome of therapy was examined. Asynchronously growing cells and synchronized cells were exposed to drugs. Medication of asynchronously growing cells was started at differ-ent time points after cell plating. Cells after a short recovery period (10h) were G1-arrested and entered the active cell cycle after a longer period of time (22h) after plating. Interest-ingly, cells after a short recovery period were less sensitive to drugs than cells at 22h post-plating. Additionally, synchronized cells released from the block were also exposed to CDK inhibitors. ROSC was able to prolong cell cycle arrest of synchronized HeLa cells only in early but not in late G1 phase.
Analysis of cellular proteins in samples obtained from untreated controls and cells treated with both CDK inhibitors for increasing periods of time by immunoblots provided details about the mechanism of the action of ROSC and OLO II.
Both inhibitors abrogated activation of CDK7 and in this way were able to repress the site-specific phosphorylation of CTD of RNA Polymerase II resulting in the block of overall transcription in HeLa cells. Transcriptional breakdown led to downregulation of E6 and E7 oncogenic proteins in HeLa cells. In untreated HeLa cells these virally encoded proteins bind and inactivate p53 and pRb, respectively, thereby contributing to malignant transfor-mation. Hence, abrogation of E6 and E7 reconstituted the G1 restriction checkpoint, evi-denced by the reactivation of pRb protein and the strong p53 upregulation after ROSC treatment. Restored p53 activity contributes to cell cycle arrest and apoptosis and repre-sents a further mechanism of ROSC action. HTB-31 cells in contrast were not affected in p53 levels, indicating that CDK inhibition is not sufficient to counteract the mutated pro-tein. Additionally, synchronization of HeLa cells with trichostatin A, a deacetylase inhibi-tor, before the actual ROSC treatment revealed improved effects of the latter in comparison to a treatment of unsynchronized cells.
Taken together, ROSC and OLO II display high therapeutic potential due to their increased selectivity towards transformed cells. Their ability to modulate the cell cycle and to induce a controlled cell death additionally is associated with relatively low, if any, cytotoxicity. The weak cytotoxicity of CDK inhibitors is a great advantage. Moreover, the pleiotropic effects exerted by ROSC and OLO II are of advantage too.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
cell cycle arrest apoptosis cyclin-dependent kinases (CDK) inhibitors of cyclin-dependent kinases (CDKI) roscovitine olomoucine II tumorsuppressor p53
Schlagwörter
(Deutsch)
Zellzyklusarrest Apoptose Cyclin-abhängige Kinasen (CDK) Inhibitoren der Cyclin-abhängigen Kinasen (CDKI) roscovitine olomoucine II Tumorsuppressor p53
Autor*innen
Andreea Ana-Maria Borza
Haupttitel (Englisch)
Outcome of treatment of human HPV-positive cervical cancer cells with selective inhibitors of CDKs
Paralleltitel (Deutsch)
Die Auswirkungen der Behandlung von humanen HPV-positiven Zervix Krebszellen mit selektiven Inhibitoren der CDKs
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
183 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Jozefa Jozefa Gadek-Wesierski
Klassifikation
42 Biologie > 42.15 Zellbiologie
AC Nummer
AC08113778
Utheses ID
6767
Studienkennzahl
UA | 441 | | |