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Development of an electrochemical assay for detection of breast cancer-associated PIK3CA point mutations using noble metal-based screen-printed sensors
Vanessa Thöny
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doktoratsstudium NAWI aus dem Bereich Naturwissenschaften (DissG: Chemie)
Betreuer*in
Peter Lieberzeit
DOI
10.25365/thesis.74337
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-25062.57048.327265-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Krebspatienten profitieren heutzutage von der laufenden Entwicklung der Krebstherapien hin zu einer personalisierten Behandlungsstrategie, die sich an der molekularen Diagnostik orientiert. Die derzeit verfügbaren Diagnosemethoden zur Analyse von tumorassoziierten Punktmutationen, welche in der Krebsdiagnostik als prädiktive oder prognostische Biomarker eine zentrale Rolle spielen, beschränken sich jedoch auf laborgestützte Nachweisverfahren. Diese haben den großen Nachteil, dass sie nur in spezialisierten klinischen Laboratorien zur Verfügung stehen und im Allgemeinen sehr zeitaufwändig und teuer sind. Daher besteht ein unerfüllter Bedarf an neuen Diagnoseverfahren, die für die routinemäßige Mutationsanalyse am Ort der Behandlung eingesetzt werden können und eine schnelle, zuverlässige und kostengünstigere Krebsdiagnostik ermöglichen, die auch für Orte mit begrenzten Ressourcen geeignet sind. Point-of-Care Diagnoseverfahren zum Nachweis von Punktmutationen in zirkulierender Tumor-DNA könnten die stetigen Fortschritte im Bereich der Krebstherapie ergänzen, den Krankheitsverlauf verbessern und die Belastung der Patienten verringern, indem sie eine frühzeitige Krebsdiagnose ermöglichen und eine Hilfestellung bei Behandlungsentscheidungen bietet. Es sind jedoch noch weitere Studien erforderlich, um das endgültige Ziel zu erreichen, ein POC-Testsystem für die Analyse tumorassoziierter Mutationen in zirkulierender Tumor-DNA zu etablieren, das in der klinischen Praxis eingesetzt werden kann. Im Rahmen dieser Dissertation sollte ein Beitrag zu diesem ehrgeizigen Ziel geleistet werden, indem ein hochsensibles und spezifisches POC-kompatibles Verfahren zur Multiplex-Analyse von drei Brustkrebs-assoziierten Punktmutationen im PIK3CA-Gen (H1047R, E545K und E542K), einem der am häufigsten mutierten und klinisch relevanten Gene bei Brustkrebs, erarbeitet wurde. Die entwickelte Methode beruht auf einem mutationsspezifischen elektrochemischen Nachweis auf im Siebdruckverfahren hergestellten Mehrkanalsensoren mittels einem enzymgekoppelten Nachweisverfahren in Kombination mit einer vorhergehenden isothermalen Rekombinase-Polymerase-Amplifikation. Zu diesem Zweck wurde zunächst ein mutationsspezifischer Assay, der auf DNA-Hybridisierung beruht, mit Hilfe von Microarray-Technologie auf einer goldbeschichteten Microarray-Plattform entwickelt, was eine umfassende Assay-Optimierung ermöglichte. Das optimierte Assay-Protokoll konnte dann erfolgreich auf siebgedruckte Goldsensoren übertragen werden und ermöglichte so die Realisierung eines mutationsspezifischen enzymgekoppelten elektrochemischen Nachweisverfahrens. Anschließende Untersuchungen zum Einfluss des Elektrodenmaterials und der Morphologie auf die Sensorleistung und Hybridisierungsspezifität ergaben, dass die hochporöse Oberfläche von gesinterten, mit Goldnanopartikeln modifizierten Elektroden besonders günstige Eigenschaften für den mutationsspezifischen DNA-Nachweis bietet und als Elektrodenmaterial der Wahl für solche Anwendungen angesehen werden sollte. Schließlich wurde eine Kombination des elektrochemischen Nachweisverfahrens mit einer vorhergehenden isothermalen Rekombinase-Polymerase-Amplifikation realisiert, wodurch die Sensitivität des gesamten Assays erheblich gesteigert werden konnte. Dies konnte durch Markierung der Ziel-DNA mit Biotin während der RPA oder durch anschließenden enzymatischen Verdau erreicht werden. Zusätzlich wurde eine Strategie zur Blockierung der Wildtyp DNA entwickelt, um die Mutationsspezifizität während der Sonden-Ziel-DNA-Hybridisierung zu erhöhen.
Abstract
(Englisch)
Cancer patients nowadays benefit from the ongoing transition of anticancer therapy towards a personalized treatment strategy guided by molecular diagnostics. However, currently available diagnostic methods for analysis of tumor-associated point mutations, which play a central role in cancer diagnostics as predictive or prognostic biomarkers, are limited to laboratory-based detection techniques. These have the major disadvantage of being only available in specialized clinical laboratories and generally being very time-consuming and expensive. Hence, there is an unmet need for novel diagnostic techniques that can be used for routine mutation analysis at the point of care, allowing for fast, reliable and more economic cancer diagnostics that are also suitable for resource-limited settings. Point-of-care (POC) diagnostic approaches for detecting point mutations in circulating tumor DNA have the potential to complement the steady progress in anticancer therapies, improving disease outcomes, and reduce patient's burden by enabling early cancer diagnosis and guiding treatment decisions. However, further effort is required to reach the final goal of establishing a POC testing system for the analysis of tumor-associated mutations in circulating tumor DNA that can be applied in clinical practice. Within the scope of this doctoral thesis, a contribution to this ambitious goal is to develop a highly sensitive and specific POC-compatible method for multiplex analysis of three breast cancer-associated point mutations in the PIK3CA gene (H1047R, E545K, and E542K) as one of the most frequently mutated and clinically relevant genes in breast cancer. The developed method relies on mutation-specific electrochemical detection with an enzyme-linked assay on multi-channel screen-printed sensors combined with prior isothermal recombinase polymerase amplification. For this purpose, first a mutation-specific hybridization-based assay was developed with the help of microarray technology on a gold-coated microarray platform, allowing for thorough assay optimization. The optimized assay protocol could then be successfully transferred to screen-printed gold sensors, thus allowing for realizing a mutation-specific enzyme-linked electrochemical assay. Subsequent investigations on the influence of the electrode material and morphology on sensing performance and hybridization specificity revealed that the highly porous surface of sintered gold nanoparticle-modified electrodes offers particularly favourable properties for mutation-specific DNA detection and should be regarded as the electrode material of choice for such applications. Finally, by combining the elctrochemical assay with prior isothermal recombinase polymerase amplification, it was possible to significantly increase the sensitivity of the overall assay. This could be achieved by labelling of the target DNA with biotin during RPA and generation of single-stranded target DNA either directly via asymmetric RPA or by subsequent enzymatic digestion. Additionally, a wild-type blocking strategy was developed to increase mutation-specificity during probe-target hybridization.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Electrochemische Biosensoren Electrochemische DNA Detektion DNA-Sensoren Siebgedruckte Sensoren Detektion von Punktmutationen Isothermale DNA Amplifikation Recombinase Polymerase Amplifikation DNA Microarray
Schlagwörter
(Englisch)
Electrochemical biosensors Electrochemical DNA detection DNA sensors Screen-printed sensors Point mutation detection Isothermal DNA amplification Recombinase polymerase amplification DNA microarray
Autor*innen
Vanessa Thöny
Haupttitel (Englisch)
Development of an electrochemical assay for detection of breast cancer-associated PIK3CA point mutations using noble metal-based screen-printed sensors
Paralleltitel (Deutsch)
Entwicklung eines elektrochemischen Tests zum Nachweis von Brustkrebs-assoziierten PIK3CA-Punktmutationen mittels edelmetallbasierter, im Siebdruckverfahren hergestellter Sensoren
Publikationsjahr
2023
Umfangsangabe
VII, 173 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Margit Cichna-Markl ,
Nikola Knezevic
AC Nummer
AC16950285
Utheses ID
67852
Studienkennzahl
UA | 796 | 605 | 419 |