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Photocleavable tools for protein synthesis
Maximilian Schrems
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doktoratsstudium NAWI aus dem Bereich Naturwissenschaften (DissG: Chemie)
Betreuer*in
Christian F. W. Becker
DOI
10.25365/thesis.74294
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-26838.56783.842811-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Durch die Entwicklung bahnbrechender (bio-)chemischer Techniken wie zum Beispiel Festphasenpeptidsynthese, der Nativen Chemischen Ligation und Expressed Protein Ligation, können ortsspezifisch modifizierte Proteine in ausreichender Menge und Reinheit für eine biologische Evaluation hergestellt werden. Die Untersuchung post-translationaler Modifikationen, wie auch zahlreiche andere Anwendungen, sind stark angewiesen auf die ortsspezifische und genaue Einführung von modifizierten Aminosäuren in eine Proteinsequenz. Im Laufe der letzten Jahrzehnte, in denen diese Techniken auf verschiedenste Proteine angewandt wurden, erforderten die Eigenschaften dieser, hauptsächlich im Zusammenhang mit deren Aminosäurezusammensetzung und Löslichkeit, die Entwicklung individueller (Semi-)Synthesestrategien für jedes dieser Proteine, was den Fortschritt in diesem Bereich verlangsamte. In dieser Arbeit setzten wir uns die Entwicklung von Methoden zum Ziel die das Angebot an verfügbaren chemischen Werkzeugen für die (Semi-)Synthese von Peptiden und Proteinen mit sehr begrenzter Löslichkeit erweitern. Eines dieser biomedizinisch höchst relevanten, aber zur Aggregation neigenden Proteine ist das Zytokin Granulozyten-stimulierender Faktor (G-CSF). Zugang zu homogen O-glykosylierten Varianten von G-CSF, um die Rolle dieser Modifikationen zu erforschen, ist begrenzt, weshalb dieses Zielprotein ausgewählt wurde. Zu diesem Zweck wurden zwei photolabile Gruppen entwickelt und getestet die (i) die chemoenzymatische Glykosylierung durch ein an einer Seitenkette verknüpftes Löslichkeitstag erleichtern und (ii) eine effiziente Ligation an nicht cysteinhaltigen Verbindungen bei geringen Konzentrationen zu ermöglichen, unter Verwendung eines Selen-basierten Ligationsauxiliars. Wir konnten zeigen, dass die temporäre Einführung eines löslichkeitssteigernden Tags die chemoenzymatische Glykosylierung von G-CSF unter nicht denaturierenden Bedingungen erleichtert und dieser Tag im Anschluss durch UV-Licht abgespalten werden kann. Ein zweites Auxiliar wurde in einer fünfstufigen Synthese in 4-6% Ausbeute erhalten. Mit diesem selenolhaltigen Ligationsauxiliar konnten wir Diselenid-Selenoesterligationen an einer Reihe von Testpeptiden untersuchen, und damit die positiven Auswirkungen unseres selenbasierten Ansatzes, aber auch einige der Unzulänglichkeiten des hier verwendeten Auxiliars zeigen. Darüber hinaus wurde die Semisynthese von G-CSF mittels einer Syntheseroute gezeigt, die bei einer chemisch ähnlichen Ligation mit einem Schwefelauxiliar versagte. Diese Ergebnisse tragen zur Entwicklung von universell einsetzbaren Werkzeugen für die Protein-(semi-) Synthese bei und unterstreichen deren Bedeutung im Hinblick auf den ungehinderten Zugang zu jedem Zielprotein.
Abstract
(Englisch)
Through the development of groundbreaking (bio-)chemical techniques such as solid phase peptide synthesis, native chemical ligation and expressed protein ligation, site-selectively modified proteins are conveniently prepared in sufficient amounts and purity for biological evaluation. The investigation of posttranslational modifications, as well as numerous other applications, heavily rely on the site-specific and precise introduction of modified amino acids into a protein sequence. Over the last decades, in which these techniques were applied to a wide variety of targets, the properties of these proteins, mostly related to amino acid composition and solubility, have required the development of individual (semi-) synthesis strategies for each protein, which has slowed down progress in this area. In this work, we aimed at developing methods to expand the set of chemical tools for the (semi-) synthesis of peptides and proteins with very limited solubility. One of such biomedically highly relevant but aggregation-prone proteins is the cytokine granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF). Access to homogeneous O-glycosylated variants of G-CSF to study the role of these modifications has been very limited, and we therefore selected this as a target protein. Towards this goal, two photocleavable moieties were developed and tested to (i) facilitate chemoenzymatic glycosylation via a side-chain-attached solubilization tag and (ii) allow efficient ligation at non-cysteine containing junctions at low concentrations using a selenium-based ligation auxiliary. We have demonstrated that the temporary introduction of a solubility-enhancing tag facilitates chemoenzymatic glycosylation of G-CSF under non-denaturing conditions and that this tag can subsequently be cleaved by UV-light. The second auxiliary was accessed via a five-step synthesis and obtained in 4-6% yield. With this selenolcontaining ligation auxiliary we were able to study diselenide-selenoester ligations on a series of test peptides and thereby show the beneficial impact this selenium-based approach has, as well as some of the shortcomings of the auxiliary scaffold used here. Moreover, the semi-synthesis of G-CSF was demonstrated via a route that failed when using the chemically similar native chemical ligation with a mercapto-auxiliary. These results contribute to the development of more universally applicable tools for protein (semi-) synthesis and highlight their importance with respect to unimpeded access to any target protein.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
native chemische Ligation Ligationsauxiliar diselenide-selenoester Ligation Selenauxiliar Festphasenpeptidsynthese
Schlagwörter
(Englisch)
native chemical ligation ligation auxiliary diselenide-selenoester ligation selenium auxiliary Solid-phase peptide synthesis
Autor*innen
Maximilian Schrems
Haupttitel (Englisch)
Photocleavable tools for protein synthesis
Paralleltitel (Deutsch)
Lichtabspaltbare Werkzeuge für die Proteinsynthese
Publikationsjahr
2023
Umfangsangabe
iv, 145 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Oliver Seitz ,
Norman Metanis
AC Nummer
AC16946424
Utheses ID
67873
Studienkennzahl
UA | 796 | 605 | 419 |