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Mycoplasma gallisepticum - host interactions

identification, localization and role of cytadherence proteins

Ivana Indikova

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Renate Rosengarten

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DOI

10.25365/thesis.7487

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29283.84645.772765-8

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Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Mycoplasma gallisepticum ist ein aviärer Krankheitserreger, der bei Vögeln respiratorische Erkrankungen oft chronischer Natur verursacht, und auch zu systemischen Infektionen führen kann. Eine entscheidende Rolle für den Infektionsverlauf spielt hierbei das Zytoadhärenzprotein GapA, welches dem Zytoadhärenzprotein P1 des humanen Krankheitserregers M. pneumoniae strukturell und funktionell sehr ähnlich ist. Interessanterweise unterscheiden sich die beiden M. gallisepticum Laborstämme Rlow und Rhigh nicht nur in ihrer Virulenz, sondern auch in Bezug auf ihre GapA-Expression. Während der virulente Stamm Rlow GapA exprimiert und für Hühner pathogen ist, exprimiert der vielfach passagierte Laborstamm Rhigh kein GapA und ist auch nicht mehr virulent. Um die Bedeutung von GapA für die Virulenz zu untersuchen, wurde die Fähigkeit von M. gallisepticum getestet, Erythrozyten in vitro zu binden (Hämadsorption [HA]). Der virulente Stamm Rlow zeigte hierbei einen HA(+)-, HA(-)- bzw. einen gemischten Phänotyp. Im Gegensatz dazu zeigte der Stamm Rhigh ausschließlich einen HA(-)-Phänotyp. Die Abwesenheit von GapA in HA(-) Rlow, oder auch in HA(-)-Derivaten wird durch eine Mutation im Gen gapA verursacht, welche sich von einer zuvor beschriebenen anderen Mutation im Gen gapA von Rhigh unterscheidet und mit einer hohen Frequenz auftritt. Im Wesentlichen korrelierte die Fähigkeit, Erythrozyten zu binden mit der Anwesenheit von GapA und CrmA. Dies wurde durch die Erzeugung der CrmA-negativen Mutante mHAD3 mittels Transposon-Mutagenese nachgewiesen. Das Zerstören des crmA-Gens führte hierbei zu einer reduzierten GapA-Expression. Durch weitere Analysen mittels RT PCR konnte gezeigt werden, dass die beiden Gene gapA und crmA auf einer polycistronischen mRNA liegen. Um die Rolle von GapA und CrmA währen der Zellinvasion und der Wirtskolonisierung zu untersuchen, wurden die Stämme Rlow, Rhigh und Derivate mit einem HA(-)-Phänotyp einem Gentamicin-Invasionsversuch unterzogen, sowie mittels Doppelter Immunfluoreszenzmikroskopie untersucht. In in vitro Experimenten wurde bereits nachgewiesen, dass weder GapA noch CrmA für eine Zellinvasion benötig werden. Dennoch sind diese Proteine für eine Translokation durch eine polarisierte Zell-Einzelschicht (Zell-Monolayer) von Bedeutung. Klone, welche weder GapA noch CrmA exprimieren und daher in nicht-phagozytotische Zellen eindringen können, sind nicht in der Lage, eine polarisierte Zell-Einzelschicht zu durchdringen. In einem in vivo Experiment wurden Hühner mittels Aerosolen, bestehend aus Rlow, Rhigh und gemischten bakteriellen Kulturen, infiziert. Die infizierten Tiere wurden dann hinsichtlich des Schweregrades von Luftsackläsionen und der Anwesenheit von M. gallisepticum in verschiedenen inneren Organen untersucht. Unabhängig der, für die Infektion eingesetzten, bakteriellen Stämme konnte M. gallisepticum aus den Atemwegen der infizierten Tieren re-isoliert werden. Viel wichtiger ist jedoch die Tatsache, dass nur Klone mit einem GapA/CrmA-positiven Phänotyp in der Lage waren, unterschiedliche innere Organe zu besiedeln. Um die Rolle der beiden Zytoadhäsine GapA und CrmA in Bezug auf die Virulenz und Wirtskolonisierung von M. gallisepticum weiter zu untersuchen, wurden Hühner mit den HA( ) Mutanten RCL2 (gapA mit einem vorzeitigen Stoppcodon) sowie mHAD3 (crmA zerstört durch ein Transposon) infiziert und wie bereits beschrieben untersucht. Die Daten zeigten, dass die Mutante mHAD3 ihre Virulenz, ähnlich wie der Stamm Rhigh, verloren hat. Die Mutante RCL2 zeigte überraschenderweise eine höhere Virulenz als Rhigh, aber dennoch eine geringere Virulenz als Rlow. Zusätzlich wurde eine Korrelation zwischen der Häufigkeit der Reisolierung aus den Luftsäcken und den inneren Organen festgestellt. Je öfters M. gallisepticum aus Luftsäcken isoliert werden konnte, desto höher war auch die Frequenz der Reisolierung aus den inneren Organen. Die Funktion einiger Zytoadhärenz-verwandten Gene von M. gallisepticum, welche im „mgc Lokus“ als Cluster vorliegen, wurde mittels gezielter Gendisruption untersucht. Hierzu wurden Suizidvektoren, welche Teile der zu disruptierenden Ziel-Gene trugen, erstellt, und in die Ziel-Genfragmente wurde eine Tetracyclinresistenzkassette (tetPO/tetM) inseriert. Unglücklicherweise konnten nach Transformation von M. gallisepticum mit diesen Suizidvektoren keine Transformanten erhalten werden. Durch das zusätzliche Hinzufügen eines Fragments des Replikationsursprungs (oriC) von M. gallisepticum war dies aber schlussendlich möglich. Eine Analyse der Transformanten zeigte, dass die Integration der Tetracyclinresistenz via homologe Rekombination nicht im gewünschten Zielgen gapA, sondern in der oriC-Region des M. gallisepticum -Genoms stattgefunden hat. Obwohl keine gewünschten “knock-out“-Mutanten hergestellt werden konnten, erlaubt dieser Vektor in der Zukunft die Entwicklung von spezifisch integrierenden Expressions-Vektoren. Um die Funktion der Genprodukte eines „erweiterten“ mgc-Operons im komplexen Prozess der Zytoadhärenz von M. gallisepticum, sowie deren Lokalisation in der Bakterienzelle zu untersuchen, wurden spezifische Antikörper entwickelt. Die ausgewählten Gene mgc2, crmB und crmC wurden in E. coli-Expressionsvektoren kloniert und ortsspezifisch mutiert, um dem andersartigen Codon usage von Mycoplasmen Rechnung zu tragen. Fusionsproteine wurden hergestellt, gereinigt, und für die Immunisierung von Kaninchen verwendet. Die gewonnenen Sera zeigten Reaktivität mit M. gallisepticum Proteinen der erwarteten Größen. Im Gegensatz zum Mgc2-spezifischen Antiserum, welches nur eine einzelne Proteinbande detektierte, wurden mit den CrmB- und CrmC-spezifischen Antiseren zusätzliche Proteine detektiert. Die Art dieser Proteine, und damit die Spezifität der Seren, muss nun mit andern Techniken, wie zum Beispiel der MALDI-TOF-Analyse oder einer 2D-Gelelektrophorese bestimmt werden.

Abstract

(Englisch)

Mycoplasma gallisepticum (MG) is an important avian pathogen that causes respiratory diseases in chickens and turkeys imposing severe commercial losses on the poultry industry worldwide. Cytadherence of MG which is the prerequisite for a successful infection is mediated by a terminal tip structure composed of several proteins with GapA being recognized as the major cytadherence protein which shares homology with the major adhesion of the human pathogen M. pneumoniae, P1. Interestingly, the well-described MG prototype strain Rlow and its highly passaged derivative Rhigh differ not only in virulence but also in the expression of GapA. While the virulent strain Rlow expresses GapA and is pathogenic for chickens, the attenuated strain Rhigh lacks GapA. In order to elucidate the role GapA in cytadherence, the ability of MG to bind erythrocytes in vitro (hemadsorption [HA]) was examined. Virulent strain Rlow displayed HA(+), HA(-) and mixed phenotypes (sectored colonies), and Rhigh was found to express exclusively the HA(-) phenotype. The absence of GapA in Rlow –derived HA(-) clones resulted from mutation in the gapA gene, which differed from the mutation previously described for Rhigh and was found to switch with a high frequency. Importantly, the ability of hemadsorbtion correlated with the presence of GapA and CrmA, which was shown by generation of the crmA-negative mutant mHAD3 using transposon mutagenesis. The disruption of the crmA gene resulted in a decreased expression of GapA. Further analysis using RT-PCR revealed that both genes, gapA and crmA, are present on a single polycistronic RNA. In order to investigate the role of the cytadherence-related proteins GapA and CrmA in cell invasion and host colonization, strains Rlow, Rhigh and several clones displaying the HA(-) phenotype were subjected to the double immunofluorescence assay and the gentamicin invasion assay. It was demonstrated that GapA and CrmA are not required for cell invasion in vitro, although they are necessary for translocation through a polarized cell monolayer, as clones lacking GapA and CrmA, though able to invade non-phagocytic cells, were unable to translocate. To simulate the situation in the host, chickens were infected by aerosol, and after necropsy they were scored for the severity of air sac lesions, as well as for the re-isolation of MG from different inner organs. Although the re-isolation from the respiratory tract was not significantly different, only clones displaying the GapA/CrmA-positive phenotype were capable of successful infection in vivo. For further elucidation of the role of the two cytadhesins, GapA and CrmA, in MG virulence and host colonization, chickens were infected by aerosol with the HA(-) mutants RCL2 (nonsense mutation in gapA) and mHAD3 (crmA disrupted by a transposon) and after necropsy scored for the severity of air sac lesions, as well as for the re-isolation of MG from different inner organs. Data indicated that the mutant mHAD3 had lost its virulence properties similarly to strain Rhigh. Surprisingly, however, the mutant RCL2 displayed a higher virulence than Rhigh, although a lower one than Rlow. Furthermore, a correlation between the frequency of re-isolation from air sacks and inner organs was observed. The more often MG was re-isolated from the air sacks, as higher was the frequency of re-isolation for inner organs. To reveal the function of various cytadherence-related genes of MG clustered in the “mgc-locus”, a project was started to develop a targeted gene disruption. Suicide vectors carrying the subcloned target gene disrupted by the tetracycline resistance gene, tetM, were created and used for transformation of MG. Unfortunately, no transformants were obtained by following this direct approach. When a fragment of MG’s origin of replication (oriC´) was added to the vector for disruption of gapA, such a modified vector gave rise to several transformants. Analyses of the clones revealed that indeed a homologous recombination event took place, however, not in the gapA locus but in the oriC region of the MG genome. Although not leading to the desired knock-out mutants, this vector allows the future development of specifically integrating expression vectors. To define the role of each gene product of an “extended” mgc operon in the complex cytadherence process of MG and their localization within the cell, the development of specific antibodies was initiated. The selected genes, namely mgc2, crmB and crmC, were subjected to a site-directed mutagenesis and cloned into E. coli expression vectors. Purified fusion proteins were used for the immunization of rabbits. The hyperimmune sera showed reactivity with MG proteins of the approximately expected sizes. With the exception of the Mgc2-specific antiserum that detected only a single band in all the clones tested, additional proteins were detected by CrmB- and CrmC-specific antisera. The characteristics of the proteins detected remains to be elucidated by other techniques, such as MALDI-TOF analysis or 2D-gel electrophoresis.

Autor*innen

Ivana Indikova

Haupttitel (Englisch)

Mycoplasma gallisepticum - host interactions

Hauptuntertitel (Englisch)

identification, localization and role of cytadherence proteins

Paralleltitel (Deutsch)

Mycoplasma gallisepticum ; Identifizierung, Lokalisierung und die Rolle der Zytoadhärenzproteine

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

120 S. : graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Rodger Novak ,

Enno Jacobs ,

Gerold Stanek

Klassifikation

30 Naturwissenschaften allgemein > 30.00 Naturwissenschaften allgemein: Allgemeines

AC Nummer

AC07452239

Utheses ID

6792

Studienkennzahl

UA | 091 | 437 | |

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Schlagwörter