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AMPK and NRF2: insights into the molecular interplay between two cell stress regulators
Sylvia Ender
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Pharmazie
Betreuer*in
Elke Heiß
Mitbetreuer*in
Eleni Petsouki
DOI
10.25365/thesis.74240
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-16624.89453.105417-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Der Transkriptionsfaktor NRF2 reguliert die zelluläre Reaktion auf oxidativen Stress – die Serin/Threonin Kinase AMPK die Reaktion auf Stress bedingt durch Energiemangel. Da bestimmte Naturstoffe beide Zellstressregulatoren zugleich aktivieren und die von NRF2 und AMPK hervorgerufenen Zellprozesse sich teilweise überlappen, wurde in der Forschung schon länger ein gewisses Zusammenspiel zwischen NRF2 und AMPK angenommen. Tatsächlich hat unsere Arbeitsgruppe kürzlich die AMPK-abhängige Phosphorylierung von NRF2 an drei Serinresten (Ser374, 408, 433) festgestellt, die sich in oder nahe der Neh6 Domäne befinden, welche für die Ubiquitinierung von NRF2 durch β TrCP2 verantwortlich ist. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es zu untersuchen, wie die von AMPK abhängigen Phosphorylierungsreste auf NRF2 den durch β-TrCP2 gesteuerten Abbau von NRF2 beeinflussen. Aus diesem Grund wurde Wildtyp-NRF2 (WT-NRF2) mit triple mutant (TM-)NRF2 (Ser374, 408, 433 mutiert zu Ala) in Bezug auf Halbwertszeit, Interaktion mit β-TrCP2 und Expression des für NRF2 spezifischen Gens Gclc verglichen. Um den Effekt von β-TrCP2 auf den Abbau von NRF2 zu erkennen, wurden die jeweiligen Experimente zu Halbwertszeit, Proximity Ligation Assay und qPCR unter Benutzung von KEAP1-defizienten MEF-Zellen durchgeführt. Inaktivierung von KEAP1 führt zu einer verstärkten Aktivierung von NRF2 und spielt in einer Reihe von pathologischen Zuständen, unter anderem Krebs, eine Rolle. Die Experimente fanden sowohl mit als auch ohne den AMPK-Aktivator A-769662 statt, um den Effekt von AMPK besser beurteilen zu können. Die Ergebnisse zeigten, dass die Mutation der von AMPK phosphorylierten Serinreste die Proteinstabilität von NRF2 erhöht. Das ist wahrscheinlich durch die herabgesetzte Interaktion zwischen TM-NRF2 und β-TrCP2 zu erklären, die mittels PLA beobachtet werden konnte. Zudem ist anhand der PLA-Ergebnisse eine gesteigerte Interaktion zwischen NRF2 und β-TrCP2 im Nukleus nach Zugabe des AMPK-Aktivators A-769662 erkennbar. Außerdem wirkt sich die Mutation der Phosphorylierungsstellen auch auf die Expression der für NRF2 spezifischen Gene aus, da die qPCR-Ergebnisse eine höhere Gclc-Genexpression bei TM-NRF2 im Vergleich zu WT-NRF2 aufweisen. Generell führen die Ergebnisse dieser Arbeit zu der Annahme, dass die AMPK-abhängige Phosphorylierung an den drei Serinresten die Interaktion von NRF2 mit β-TrCP2 erhöht. Dadurch wird der von β-TrCP2 abhängige Abbau von NRF2 gesteigert, was infolgedessen die von NRF2 kontrollierte Genexpression erniedrigt.
Abstract
(Englisch)
The transcription factor NRF2 and the serine/threonine kinase AMPK regulate the cellular response to redox and energy stress, respectively. Due to their concomitant activation when exposed to certain natural products and the overlapping cellular processes induced by NRF2 and AMPK signaling, a certain cooperativity between NRF2 and AMPK has been reported in previous studies. Recently, our lab has discovered three targets of AMPK-dependent phosphorylation (Ser374, 408, 433), which are located within or near to the Neh6 domain that is responsible for the β-TrCP-mediated ubiquitination of NRF2. The aim of this thesis was to examine how the identified AMPK-dependent phospho-sites on NRF2 can affect its β-TrCP2-mediated degradation. Therefore, the wild type form of NRF2 (WT-NRF2) was compared with triple mutant (TM-)NRF2 (mutation of Ser374, 408,433 to Ala) in terms of their protein half-life, their interaction with β-TrCP2 and their expression of the NRF2 target gene Gclc. In order to unmask the effects of β-TrCP2 in the degradation of NRF2, the respective half-life experiments, proximity ligation assays and qPCR assays were performed using KEAP1 depleted MEF cells. KEAP1 inactivation results in NRF2 hyperactivation and has been involved in many pathological conditions including cancer. Experiments were further conducted with and without the presence of the AMPK-activator A-769662 to investigate the influence of AMPK in more detail. The data showed that mutation of the AMPK-dependent phosphorylation sites in NRF2 caused an increase in NRF2 protein stability. This is likely the consequence of the impeded interaction between TM-NRF2 and β-TrCP2 as was revealed using PLA. In addition, upon exposure to the AMPK-activator A-769662, PLA results demonstrated an enhanced nuclear interaction of NRF2 forms with β-TrCP2. Furthermore, mutation of the phosphorylation sites seems to also affect NRF2 target gene expression, as qPCR results show that TM-NRF2 elicits higher Gclc expression than WT-NRF2. Overall, the data suggest that the AMPK-dependent phosphorylation at the three serine residues in NRF2 promotes its interaction with β-TrCP2, thus facilitating its degradation in a β-TrCP2-dependent manner and leading to a decrease in the expression of selected NRF2 target genes.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
NRF2 AMPK β-TrCP2 FBXW11 KEAP1 A-769662 Krebs
Schlagwörter
(Englisch)
NRF2 AMPK β-TrCP2 FBXW11 KEAP1 A-769662 cancer
Autor*innen
Sylvia Ender
Haupttitel (Englisch)
AMPK and NRF2: insights into the molecular interplay between two cell stress regulators
Paralleltitel (Deutsch)
AMPK und NRF2: ein Blick auf das Zusammenspiel der beiden Zellstressregulatoren auf molekularer Ebene
Publikationsjahr
2023
Umfangsangabe
64 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Elke Heiß
AC Nummer
AC16937430
Utheses ID
68295
Studienkennzahl
UA | 066 | 605 | |