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NMR experiments to study the conformational behavior of biomimetic systems
Ludovica Martina Epasto
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doktoratsstudium NAWI aus dem Bereich Naturwissenschaften (DissG: Chemie)
Betreuer*in
Dennis Kurzbach
DOI
10.25365/thesis.79496
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-13270.07585.247664-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Proteine durchlaufen häufig Konformationsübergänge, um ihre biologischen Funktionen zu erfüllen. In Anbetracht ihrer grundlegenden Bedeutung für physiologische Prozesse ist somit eine umfassende Charakterisierung ihres Konformationsraums erforderlich. Biomimetische Systeme, die die Eigenschaften natürlicher Strukturen und Prozesse nachahmen, können als Modelle eingesetzt werden, um dieses Ziel zu erreichen.
Die NMR ist eine leistungsfähige Methode zur Untersuchung struktureller Übergänge in hochdynamischen biomimetischen Systemen. Der Konformationsraum der Proteine umfasst jedoch viele schwer zugängliche vorübergehende Konformationen. Darüber hinaus können Umweltfaktoren wie Proteinkonzentration, Temperatur oder pH-Wert das strukturelle Verhalten der Proteine beeinflussen. Diese Faktoren schränken die Eignung herkömmlicher NMR Methoden ein, da hochkonzentrierte Proben und lange Aufnahmezeiten erforderlich sind, um aussagekräftige Spektren zu erhalten.
Um NMR-Experimente an biomimetischen Systemen unter herausfordernden Bedingungen durchzuführen, konzentriert sich diese Arbeit auf niedrige Substratkonzentrationen und kurzlebige Zwischenprodukte. Mit diesem Ziel habe ich hyperpolarisierte NMR durch dynamische Kernpolarisation (DNP) mit etablierten Methoden wie Echtzeit-NMR, 13C-15N Korrelationsspektroskopie, kontinuierlicher Dauerstrich-ESR, Abstandsmessungen im Nanobereich und molekulardynamischen Simulationen (MD) kombiniert.
In dieser Arbeit habe ich das Konformationsverhalten von vier biomimetischen Modellen mit Hilfe des oben erwähnten integrierten Ansatzes charakterisiert:
1. Transkriptionsfaktoren (TFs) zeichnen sich durch eine hohe konformelle Plastizität aus, die auf das häufige Vorkommen von intrinsisch ungeordneten Regionen (IDRs) zurückzuführen ist. Ein Beispiel für einen flexiblen TF ist der MYC-assoziierte Faktor X (MAX), ein teilweise ungeordneter basicher helix-loop-helix lediesecine zipper (bHLH-LZ) TF, der an Krebs beteiligt ist. Der erste Teil meiner Dissertation konzentriert sich auf die Charakterisierung des Konformationsgleichgewichts von MAX in Gegenwart mehrerer Interaktionspartner. In Lösung bildet MAX das Homodimer MAX:MAX, das eine 6-Nukleotide-DNA-Zielsequenz (EBOX) binden kann. In Anwesenheit seines Hauptinteraktionspartners MYC heterodimerisiert MAX und bildet den transkriptionell aktiven Komplex MYC:MAX-DNA. Interessanterweise reguliert das Brustkrebs-1-Anfälligkeitsprotein (BRCA1) ebenfalls das MYC:MAX-DNA-Interaktionsnetzwerk, indem es MYC und DNA direkt bindet. Eine detaillierte, rückstandsaufgelöste Beschreibung des Einflusses von BRCA1 auf den trimeren Komplex steht jedoch noch aus, da die Dimere aufgrund der stark anisotropen Rotation eine geringe Intensität aufweisen. Insbesondere transiente Zustände sind schwierig zu charakterisieren. In dieser Arbeit wird der Einfluss von BRCA1 auf die Konformationsübergänge von MYC und MAX während der DNA-Bindung und Heterodimerisierung aufgeklärt. BRCA1 konkurriert mit dem MAX-Homodimer um die DNA-Bindung und verschiebt das strukturelle Gleichgewicht von MAX in Richtung seiner monomeren Konformation. Darüber hinaus bildet BRCA1 einen hochdynamischen Komplex mit dem MAX-Monomer, welcher die Heterodimerisierung des letzteren behindert. In Anbetracht der Beteiligung von BRCA1 an Brust- und Eierstockkrebs ist ein tiefes Verständnis der modulierenden Wirkung von BRCA1 auf den MYC- und MAX-Konformationsraum von entscheidender Bedeutung für die Suche nach neuen möglichen Zielen für klinische Anwendungen.
2. Das im vorangegangenen Abschnitt vorgestellte Protein MAX zeichnet sich durch eine hohe strukturelle Variabilität aus und nimmt je nach Umgebungsbedingungen unterschiedliche Konformationen an; daher stellt MAX das zweite in dieser Arbeit vorgestellte Modell für Konformationsvariationen dar. Insbesondere der Übergang von MAX von einem Monomer zu einem Homodimer und umgekehrt wird durch Temperatur- und pH-Änderungen beeinflusst. Unter Verwendung von dDNP zur Verstärkung der NMR-Signale des Proteins wird der Konformationsraum von MAX bei niedrigen Konzentrationen untersucht. Durch die Integration von Computertechniken in dDNP war es möglich, MAX bei mikromolaren Konzentrationen zu untersuchen und einen bisher unbekannten globulären Konformationszustand von MAX zu beschreiben. In Anbetracht der Bedeutung des Zugangs zu physiologischen Konzentrationen in Strukturdynamikstudien integriert der vorgeschlagene Ansatz dDNP und MD-Simulationen, um eine detaillierte Charakterisierung des Konformationsverhaltens von MAX bei semi-physiologischen Konzentrationen zu ermöglichen.
3. Der dritte Teil dieser Arbeit dient zur Ergänzung der Mechanismen der Hyperpolarisationsübertragung auf Biomoleküle. Die Menge der mit dDNP kompatiblen Substrate wurde vergrößert, durch die Möglichkeit, die Signale von Molekülen mit Hilfe von hyperpolarisiertem Wasser zu verstärken. Die Modalitäten der Hyperpolarisationsübertragung vom Wasser auf die Zielmoleküle sind jedoch noch unklar. Um Licht in diese Mechanismen zu bringen, wurden dDNP, MD-Simulationen und Vorhersagen von Kreuzrelaxationsraten auf zwei Modellsysteme angewendet: eine Arginin- und eine Polyaspartatlösung. Auf diese Weise konnte charakterisiert werden, wie die drei wichtigsten Polarisationsübertragungsmechanismen, nämlich der direkte nukleare Overhauser-Effekt (NOE), der austauschvermittelte NOE und der chemische Austausch, zur Polarisation biomolekularer Substrate in dDNP beitragen.
4. Das letzte Beispiel befasst sich mit der Charakterisierung von Pränukleationsspezies (PNS) in biomimetischen Lösungen. Damit soll die Fähigkeit der Echtzeit-NMR zu demonstriert werden, transiente Spezies zu beschreiben, die nicht auf Proteinen basieren, aber dennoch biologisch relevant sind. Simulierte Körperflüssigkeiten (SBF) sind metastabile Lösungen, die die Ionenkonzentration des menschlichen Blutplasmas nachahmen, welches früher als Modell für die Untersuchung von PNS verwendet wurde. PNS sind vorübergehende Vorläufer der endgültigen kristallinen Strukturen auf dem kürzlich vorgeschlagenen nichtklassischen Kristallisationsweg. Mit Hilfe von Echtzeit-31P-NMR, Kalziumpotentiometrie, energiedispersiven Röntgenspektren (XEDS), Cryo-TEM und Computersimulationen zur Charakterisierung von modifiziertem SBF (mSBF, einer simulierten Körperflüssigkeit mit zeitlich stabilem pH-Wert) wird die Entwicklung von Kalziumphosphat auf dem nichtklassischen Kristallisationsweg verfolgt. Calciumphosphat-Inhomogenitäten im Nanomaßstab beginnen sich ab 5 Stunden nach der Herstellung von mSBF zu bilden und wachsen zu größeren und stabileren Strukturen heran, die nach 24 Stunden bis zu 200 nm groß sind, wie durch DOSY-NMR und Cryo-TEM bestätigt wird. Diese Ergebnisse zeigen, dass mSBF erst ~24 Stunden nach der Herstellung zu einer stabilen oder metastabilen Lösung wird.
Die Integration neuartiger spektroskopischer Methoden in bestehende strukturbiologische Verfahren ermöglicht es, einige der Empfindlichkeitsbeschränkungen von NMR Spektroskopie zu überwinden. Mit Hilfe leistungsfähiger Techniken wie dDNP, NMR, EPR und MD-Simulationen kann das Konformationsverhalten wichtiger Transkriptionsfaktoren wie MAX oder BRCA1 mit atomarer Präzision bestimmt werden, selbst wenn herkömmliche Techniken keine ausreichende Empfindlichkeit bieten. Die Bereitstellung neuer Informationen über das Konformationsverhalten medizinisch relevanter Proteine und Peptide könnte neue Wege für die Entwicklung innovativer Therapeutika aufzeigen, die z. B. auf vorübergehende Konformationszustände abzielen.
Abstract
(Englisch)
Proteins often undergo conformational transitions to fulfill their biological roles. Considering their fundamental importance in physiological processes, an exhaustive characterization of their conformational space is needed. Biomimetic systems, which mimic the features of natural structures and processes, can be employed as models to achieve this goal.
NMR is a powerful method to study structural transitions in highly dynamic biomimetic systems. However, the proteins’ conformational space comprises many hardly accessible transient conformations. Additionally, environmental factors, such as protein concentration, temperature, or pH, can influence their structural behavior. These factors limit the suitability of conventional NMR, which demands highly concentrated samples and long acquisition times to obtain informative spectra.
To perform NMR experiments on biomimetic systems under challenging conditions, this thesis focuses on low substrate concentration and short-lived intermediates. I integrated hyperpolarized NMR by dissolution dynamic nuclear polarization (DNP) with established methodologies, such as real-time NMR, 13C-15N correlated NMR, continuous wave EPR, nanoscale distance measurements, and molecular dynamic (MD) simulations.
In this thesis, I characterized the conformational behavior of four biomimetic models by employing the abovementioned integrated approach:
1. Transcription factors (TFs) feature high conformational plasticity due to the abundant presence of intrinsically disordered regions (IDRs). An example of flexible TF is represented by the MYC-associated factor X (MAX), a partially disordered basic helix-loop-helix leucine zipper (bHLH-LZ) TF involved in cancer. The first part of my thesis focuses mainly on characterizing MAX’s conformational balance in the presence of several interaction partners. In solution, MAX forms the homodimer MAX:MAX, which can bind a 6-nucleotides DNA target sequence (EBOX). MAX heterodimerizes in the presence of its main interaction partner MYC, forming the transcriptionally active complex MYC:MAX-DNA. Interestingly, the breast cancer 1 susceptibility protein (BRCA1) also regulates the MYC:MAX-DNA interaction network, directly binding MYC and DNA. However, a detailed residue-resolved description of BRCA1’s influence on the trimeric complex is still missing since the dimers provide low intensity due to strongly anisotropic tumbling. In particular transient states are challenging to characterize. Herein, the modulation expressed by BRCA1 on the conformational transitions involving MYC and MAX during DNA binding and heterodimerization processes is elucidated. BRCA1 competes with MAX homodimer for DNA binding, shifting MAX’s structural balance to its monomeric conformation. Additionally, BRCA1 forms a highly dynamic complex with the MAX monomer, hindering the heterodimerization of the latter. Considering the involvement of BRCA1 in breast and ovarian cancer, a deep understanding of BRCA1’s modulatory effect on MYC and MAX conformational space is of pivotal importance in finding new possible targets for clinical applications.
2. The protein MAX, introduced in the previous section, features high structural variability, populating different conformations depending on the environmental conditions; therefore, MAX represents the second model of conformational variations presented in this thesis. Particularly, MAX’s transition from a monomer to a homodimer, and vice versa, is influenced by changes in temperature and pH. Employing dDNP to boost the NMR signals of the protein, MAX’s conformational space at low concentrations is explored. Integrating computational techniques to dDNP, it was possible to access MAX at micromolar concentrations and to describe a previously uncharted globular-looking conformational state of MAX. Considering the importance of accessing physiological concentrations in structural dynamics studies, the approach proposed integrates dDNP and MD simulations to provide a detailed characterization of MAX conformational behavior at semi-physiological concentrations.
3. The third part of this thesis supplements the mechanisms for hyperpolarization transfer to biomolecules. The possibility to boost the signals of molecules employing hyperpolarized water has widened the range of substrates compatible with dDNP. However, the modalities of hyperpolarization transfer from the water to the targets of interest are still unclear. To shed light on these mechanisms, dDNP, MD simulations, and cross-relaxation rates predictions are applied to two model systems: an arginine and a polyaspartate solution. In this way, it was possible to characterize how the three main polarization transfer mechanisms, namely direct nuclear Overhauser effect (NOE), exchange-relayed NOE, and chemical exchange contribute to the polarization of biomolecular substrates in dDNP.
4. The last example focuses on characterizing prenucleation species (PNS) in biomimetic solutions to demonstrate the prowess of real-time NMR to describe transient species that are not protein-based but still biologically relevant. Simulated body fluids (SBFs) are metastable solutions mimicking the ionic concentration of human blood plasma, previously used as a model for the study of prenucleation species (PNS). PNS are transient precursors of the final crystalline structures in the recently proposed non-classical crystallization pathway. Employing real-time 31P NMR, calcium potentiometry, x-ray energy dispersive spectra (XEDS), Cryo-TEM, and computer simulations to characterize modified SBF (mSBF, a simulated body fluid with stable pH over time), the evolution of calcium phosphate following the non-classical crystallization pathway is monitored. Calcium phosphate nanoscale inhomogeneities start forming after 5 hours from mSBF preparation and grow into bulkier and more stable structures, up to 200 nm after 24 hours, as confirmed by DOSY NMR and Cryo-TEM. These results indicate that mSBF becomes a stable or metastable solution only after ~24 hours from preparation.
The integration of novel spectroscopic methods into existing structural biology methodologies enables the overcoming of some of the sensitivity constraints of NMR. By means of powerful techniques such as dDNP, NMR, EPR, and MD simulations, the conformational behavior of key transcription factors like MAX or BRCA1 can be determined with atomistic precision even when conventional techniques do not provide enough sensitivity. Delivering novel information on the conformational behavior of medicinally relevant proteins and peptides could chart novel routes for developing innovative therapeutics, targeting, for example, transient conformational states.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
NMR dDNP DNP intrinsisch ungeordnete Proteine MAX
Schlagwörter
(Englisch)
NMR dDNP DNP intrinsically disordered proteins MAX
Autor*innen
Ludovica Martina Epasto
Haupttitel (Englisch)
NMR experiments to study the conformational behavior of biomimetic systems
Paralleltitel (Deutsch)
NMR-Experimente zur Untersuchung des Konformationsverhaltens von biomimetischen Systemen
Publikationsjahr
2023
Umfangsangabe
210 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Tobias Madl ,
Dariush Hinderberger
AC Nummer
AC16990786
Utheses ID
68609
Studienkennzahl
UA | 796 | 605 | 419 |