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Structure determination of TbBL232 N-terminal domain by X-ray crystallography
Rui Qiang Chen
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Gang Dong
DOI
10.25365/thesis.74679
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-27382.05690.751780-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Trypanosoma brucei ist ein einzelliges Protozoon, das in afrikanischen Staaten südlich der Sahara vorkommt. Dieser einzellige Organismus führt eine ausschließlich parasitäre Lebensweise und ist für die letale Schlafkrankheit bei Menschen verantwortlich, die das Leben von über 60 Millionen Menschen bedroht. T. brucei hat einen spindelförmigen Zellaufbau mit einem einzelnen Flagellum am hinteren Zellkörper. Die Geißel entspringt aus einer speziellen Einstülpung an der Plasmamembran die als Flagellar Pocket (FP, dt. Flagellumtasche) bezeichnet wird. Die Endo- und Exozytose finden ausschließlich im FP statt, weshalb diese Struktur eine essenzielle Rolle in der Parasit-Wirt Interaktion einnimmt. An der Ursprungsstelle des Flagellums befindet sich eine ringartige Struktur, genannt Flagellum Pocket Collar (FPC, dt. Flagellumtaschenkragen). TbBILBO1 ist die hauptsächliche Komponente, die im FPC bestimmt wurde. Es ist ein Multidomänenprotein bestehend aus einer N-terminalen Domäne (NTD), 2 EF-Hand Aminosäurenmotive, eine Coiled-Coil Domäne und ein Leucin Zipper am C-Terminus. Flagellum Pocket Collar 4 (FPC4) wurde als Bindungspartner identifiziert. Dieser bindet die NTD von TbBILBO1 mithilfe seiner C-terminale BILBO1 Bindungsdomäne (B1BD). Jedoch wird die B1BD ebenfalls von anderen Proteinen gebunden, wie bei TbBL232, dessen NTD eine 35-prozentige Sequenzhomolgie zu TbBILBO1 NTD aufweist. Die Struktur und der Bindungsmechanismus zwischen TbBL232 und FPC4 sind zum Großteil unbekannt. Ziel dieser Studie ist, zu verstehen wie die NTD von TbBL232 FPC4 bindet mittels Röntgenkristallographie. Dafür wurden beide Interaktionspartner in E. coli (DE3) co-exprimiert und mithilfe von verschiedenen Hochleistungsflüssigkeitschromatographiemethoden aufgereinigt. Die Kristallisation von TbBL232 NTD und FPC4 wurde durch in-situ Proteolyse mit Trypsin realisiert. Die Proteinkristalldaten wurden in der European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) erfasst und das Protein-Modell wurde in COOT erstellt. Die Elektronendichtekarte zeigte sowohl eine am C-Terminus um 28 Aminosäuren verkürzte Variante des TbBL232 NTD als auch das Fehlen von FPC4. Unter Berücksichtigung der strukturellen Homologie der N-terminalen Domänen von TbBL232 und TbBILBO1 wird angenommen, dass die C-terminalen Aminosäuren 91-119 von TbBL232 ebenfalls eine lange Schleifenstruktur ausbilden, die einen Teilbereich der hydrophoben Bindungstasche bildet. Um die Signifikanz dieser Region zu verstehen, wurden kurze Konstrukte von TbBILBO1 und seinen homologen Proteinen TbBL271 und TbBL232, die keine Schleifenregionen aufweisen, für isotherme Titrationskalorimetrie-Versuche hergestellt. Die verkürzten Proteine verloren vollständig die Fähigkeit FPC4 zu binden, was auf eine essenzielle Rolle dieser Struktur hindeutet.
Abstract
(Englisch)
Trypanosoma brucei is a unicellular protozoan found in Sub-Saharan African countries. This single-celled organism leads an exclusively parasitic lifestyle and causes the lethal sleeping sickness in humans, threatening the lives of over 60 million people. T. brucei’s cell architecture is spindle-shaped with a single flagellum attached to the posterior cell body. The flagellum originates from a specialized invagination of the plasma membrane described as the flagellar pocket (FP). Endo- and exocytosis are limited to the FP, which gives it an essential role for parasite-host interaction. The exit site of the flagellum harbours a “ring” structure called flagellar pocket collar (FPC). TbBILBO1 is the predominant component found in the FPC. It is a multidomain protein composed of an N-terminal domain (NTD), two EF-hand motifs, a large coiled-coil (CC) domain and a C-terminal leucine zipper. Flagellum pocket collar 4 (FPC4) has been identified as a binding partner, which binds to TbBILBO1 NTD via its C-terminal BILBO1 binding domain (B1BD). However, FPC4 B1BD is also targeted by other proteins such as TbBL232, the NTDs of which share a 35 % sequence homology with the TbBILBO1 NTD. The structure and the binding mechanism of TbBL232 NTD to FPC4 are poorly understood. The aim of this work was to understand how TbBL232 NTD binds to FPC4 by employing x-ray crystallography. For that purpose, both interaction partners were co-expressed in E. coli (DE3) and purified using different types of High-Performance Liquid Chromatography (HPLC). Crystallization of TbBL232 NTD was achieved by in-situ proteolysis using trypsin. Protein crystal diffraction data were collected at the European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) and the protein model was built in COOT. The electron density map revealed a truncated TbBL232 NTD missing about 28 residues at the C-terminus as well as the FPC4 ligand. Considering the structural homology of TbBL232 NTD and TbBILBO1 NTD, the C-terminus (aa 91-119) of TbBL232 is also believed to form a long dynamic loop which might constitute a section of the hydrophobic binding site. To gain a better understanding of the importance of this loop region, short missing loop NTD constructs of TbBILBO1 and its homologs TbBL271 and TbBL232 were generated for ligand binding tests via isothermal titration calorimetry (ITC). The truncated proteins lost their capability to bind FPC4, indicating a crucial role for this previously reported dynamic region.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Trypanosoma brucei BILBO1 FPC4
Autor*innen
Rui Qiang Chen
Haupttitel (Englisch)
Structure determination of TbBL232 N-terminal domain by X-ray crystallography
Publikationsjahr
2023
Umfangsangabe
60 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Gang Dong
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC16986109
Utheses ID
68854
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |