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Entwicklung einer Duplex Real Time PCR-Methode zur gleichzeitigen Bestimmung von Sesam und Erdnuss in Lebensmitteln
Sabrina Niedermayer
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Betreuer*in
Margit Cichna-Markl
DOI
10.25365/thesis.7702
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29354.93134.559854-0
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Allergische Reaktionen werden heutzutage vor allem in Industrieländern zu einem immer größer werdenden Gesundheitsproblem. Sesam und Erdnuss gehören zu den 14 Lebensmittelzutaten, die laut EU-Richtlinien deklarationspflichtig sind. Um die Einhaltung der gesetzlichen Regelungen überprüfen zu können, benötigt man Analysemethoden, die die Detektion der deklarationspflichtigen allergenen Zutaten ermöglichen.
In unserer Arbeitsgruppe wurden bereits eine Real Time PCR-Methode zur Detektion von Sesam und eine Duplex-Real Time PCR-Methode zu gleichzeitigen Detektion von Sesam und Haselnuss in Lebensmitteln entwickelt und validiert.
Ziel dieser Arbeit war es, eine Duplex-Real Time PCR-Methode zur gleichzeitigen Detektion von Sesam und Erdnuss in Lebensmitteln zu entwickeln. Zunächst wurde ein Singleplex-Assay für die Amplifizierung und Detektion der Erdnuss unter Anpassung an die Bedingungen der bereits entwickelten Methode für Sesam erarbeitet.
Für Sesam wurde das Gen, welches für das Hauptallergen Ses i 1 codiert, und für die Erdnuss die Gene, die für die allergenen Proteine Agglutinin, Oleosin und Ara h 6 codieren, herangezogen. Für Letztere wurden Primer und Sonden entworfen und die Primerkonzentrationen sowie Annealingtemperaturen optimiert. Im Anschluss wurden mit den 3 Primerpaaren Kreuzreaktivitätstests mit 28 gängigen Zutaten (Nüsse, Leguminosen, Getreidearten etc.) von Erdnuss- und auch Sesamprodukten durchgeführt. Die für Agglutinin und Ara h 6 entworfenen Primerpaare schieden im Verlauf dieser Tests aus. Für das Primerpaar, das zu einer Sequenz des Oleosin-Gens komplementär war, wurde die zugehörige TaqMan®-Sonde entworfen und ebenfalls die Konzentration optimiert. Die TaqMan®-Sonde der Erdnuss wurde mit dem Fluorophor Cy5 und dem Quencher BHQ2 und die TaqMan®-Sonde des Sesams mit FAM bzw. BHQ2 markiert.
Die Amplifikationseffizienz des Erdnuss-Singleplex-Assays wurde durch eine Verdünnungsreihe eines reinen Erdnuss-DNA-Extraktes von 1:1 bis
1:100 000 ermittelt, sie betrug 91,8%.
Im Anschluss wurde die Duplex-Methode entwickelt und auch hier die Amplifikationseffizienz durch die jeweiligen Verdünnungsreihen eines reinen Erdnuss- bzw. Sesam-DNA-Extraktes bestimmt. Diese betrug für die Erdnuss 99,7% und für Sesam 94,0%. In beiden Fällen konnte die DNA bis zu einer Verdünnung von 1:10 000 detektiert werden, dies entspricht einer absoluten Menge von 10 pg. Zur Bestimmung der Nachweisgrenze des Duplex-Assays für Sesam und Erdnuss wurden zwei Matrizes (Zwieback, Grissini) mit Erdnuss und Sesam in verschiedenen Konzentrationen gespikt und mit diesen eine Standardfunktion ermittelt. In Zwieback wurde eine Amplifikationseffizienz von 94,6% für Erdnuss und 83,2% für Sesam ermittelt. Beide konnten bis zu einer Konzentration von 50 mg/kg nachgewiesen werden. Im Falle der Grissini konnte eine Amplifikationseffizienz von 113,9% für Erdnuss und 91,45% für Sesam bestimmt werden. Bei den Grissinis konnten Erdnuss und Sesam bis zu einer Konzentration von 100 mg/kg reproduzierbar detektiert werden.
Des Weiteren wurden 22 verschiedene, kommerziell erhältliche Lebensmittel, wie Cracker, Kekse, Müsliriegel etc. auf Spuren von Sesam und/oder Erdnuss zur Überprüfung der Methode untersucht.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Real Time PCR Erdnuss Sesam
Autor*innen
Sabrina Niedermayer
Haupttitel (Deutsch)
Entwicklung einer Duplex Real Time PCR-Methode zur gleichzeitigen Bestimmung von Sesam und Erdnuss in Lebensmitteln
Paralleltitel (Englisch)
Development and validation of a duplex real-time PCR method allowing the simultaneous detection of sesame and peanut in food
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
130 S. : graph. Darst.
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Margit Cichna-Markl
Klassifikation
35 Chemie > 35.23 Analytische Chemie: Allgemeines
AC Nummer
AC08103777
Utheses ID
6944
Studienkennzahl
UA | 419 | | |