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Establishment of recombinant Cas9 production and characterization
Carla Maria Lebada
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Pharmazie
Betreuer*in
Ulrich Lächelt
DOI
10.25365/thesis.75134
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-12870.71202.125077-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das System CRISPR-Cas9 (Akronym aus dem Englischen: clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) - CRISPR associated (Cas)9), ist ein Instrument für sequenz- spezifische Genmodifizierung, das mit seiner einfachen Programmierbarkeit besticht. Es handelt sich um ein für gentechnische Zwecke auf zwei Komponenten reduziertes Zusammenspiel aus einer single guide RNA (sgRNA) und einer Cas9 Endonuklease. Diese setzen sich zu einem Ribonukleoprotein-Komplex zusammen und müssen als solcher in den Nukleus gelangen, um ihre Wirkung zu entfalten. Die leicht modifizierbare sgRNA definiert die DNA-Zielsequenz und dirigiert den Komplex zum entsprechenden Angriffsort im Genom, wo das Cas9 Protein einen Doppelstrangbruch einführt. Die vorliegende Arbeit trug dazu bei, die Grundlage für das Testen von Ribonukleoprotein- Transportvehikeln für Cas9, sowie ferner für fortgeschrittenere Cas9-Varianten, am Department für Pharmazeutische Wissenschaften der Universität Wien in der Abteilung für Pharmazeutische Technologie und Biopharmazie zu schaffen. Im Zuge dessen wurde die Expression von rekombinantem Cas9 in E. coli mit automatisierter Aufreinigung unter Gewinnung enzymatisch aktiver Proteine erfolgreich implementiert. Weiters wurden ein In- vitro Cleavage Assay, für den ein lineares EGFP Gen herangezogen wurde, und ein In-Vitro Zellassay mit HeLa GFP-Tub Zellen etabliert. Für die intrazelluläre Verabreichung dienten 10% succinylierte Polyethylenimine verschiedenen durchschnittlichen Molekulargewichts (10, 25 und 70 kDa im unmodifizierten Zustand) und ein künstliches Oligopeptid mit der Bezeichnung UV_1 als Trägermaterialien. In Verbund mit Cas9/sgRNA Ribonukleoproteinen wurden diese zu Nanopartikeln assembliert. Als solche zeigten die succinylierten Polymere keinen signifikanten, das Oligopeptid UV_1 hingegen einen eindeutigen GFP Knockout in HeLa GFP- Tub Zellen. Eine infolgedessen durchgeführte Dosistitration von UV_1-Nanopartikeln zeigte einen GFP-Knockout von 5 bis 27% bei Ribonukleoprotein-Konzentrationen von 4,7 bis 75 nM, wobei sich 18,75 nM als die vielversprechendste Konzentration herausstellte.
Abstract
(Englisch)
The clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR) - CRISPR associated (Cas)9 system is a sequence-specific genome editing tool that impresses with its ease of programmability. For genetic engineering purposes, the system is typically reduced to two components, a single guide RNA (sgRNA) and an endonuclease Cas9, which assemble to a ribonucleoprotein complex and require nuclear entry. The readily modifiable sgRNA defines the target sequence and guides the complex to the corresponding DNA site within the genome, where Cas9 introduces a double strand break. This thesis has contributed to the groundwork for the testing of ribonucleoprotein delivery vehicles for Cas9, as well as enhanced Cas9 variants, at the Department of Pharmaceutical Sciences, Division of Pharmaceutical Technology and Biopharmaceutics of the University of Vienna. Within this scope, the expression of recombinant Cas9 in E. coli via automated purification was successfully implemented, yielding enzymatically active proteins. Furthermore, an in vitro cleavage assay using a linear EGFP gene and an in vitro cell assay using HeLa GFP-Tub cells were established. As carrier materials for intracellular delivery, 10% succinylated polyethylenimines of different average molecular weight (10, 25 and 70 kDa before succinylation) showed no significant GFP knockout and an artificial oligopeptide termed UV_1 was able to mediate distinct GFP knockout in HeLa GFP-Tub cells when associated with Cas9/sgRNA ribonucleoproteins to form nanoparticles. Subsequent dose titration of UV_1 nanoparticles demonstrated GFP knockout ranging from 5 to 27% for ribonucleoprotein concentrations of 4.7 to 75 nM, with the most promising being 18.75 nM.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
CRISPR-Cas9 Cas9 CRISPR Cas9
Schlagwörter
(Englisch)
CRISPR-Cas9 Cas9 CRISPR Cas9
Autor*innen
Carla Maria Lebada
Haupttitel (Englisch)
Establishment of recombinant Cas9 production and characterization
Paralleltitel (Deutsch)
Etablierung der Produktion und Charakterisierung von rekombinantem Cas9
Publikationsjahr
2023
Umfangsangabe
86 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Ulrich Lächelt
AC Nummer
AC17053313
Utheses ID
69777
Studienkennzahl
UA | 066 | 605 | |