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Optimization of multiplexed assays for in vitro splice correction and cytotoxicity
Stefanie Kaufmann
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Pharmazie
Betreuer*in
Manfred Ogris
Mitbetreuer*in
Haider Sami
DOI
10.25365/thesis.75218
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-13931.87823.675395-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
„Splice switching“-Oligonukleotide (SSO) können prä-mRNA-Transkripte durch Wechselwirkungen mit der Spleißmaschinerie verändern, um defekte oder fehlende Proteine wiederherzustellen, die andernfalls Krankheiten verursachen würden. Zellbasierte In-vitro-Assays sind wesentliche Instrumente für die Entwicklung dieser SSO-basierten RNA-gerichteten Therapeutika zur Untersuchung ihrer Transfektionseffizienz und ihres Zellviabilitätsprofils. Polymere auf der Basis von Polyethylenimin (PEI) mit unterschiedlichen Strukturen und Funktionalitäten wirken als effiziente Transfektionsmittel, indem sie Nukleinsäuren wie SSOs komplexieren und in die Zelle transferieren. In der vorliegenden Arbeit wurden zellbasierte Assays zur Untersuchung verschiedener Versionen von PEI-basierten SSO-Polyplexen auf ihre Transfektionseffizienz und ihr Effekt auf die Zellviabilität an der menschlichen Gebärmutterhalskrebs-Zelllinie HeLa pLuc705 und an primären Endothelzellen porcinen Ursprungs (PEC) durchgeführt. Es war wichtig, zunächst den Resazurin-Assay für beide Zelltypen zu optimieren, bevor die Zytotoxizität der Polyplexe untersucht wurde. HeLa pLuc705 und PEC wurden in unterschiedlichen Zellzahlen ausgesät und der Resazurin-Assay wurde durch fluorometrische Auslesung des Überstands und anschließende Ermittlung einer Kalibrationsgerade durchgeführt. Frisch hergestellte Resazurinlösung und handelsübliches Alamar Blue HS-Reagenz wurden hinsichtlich ihrer Empfindlichkeit, Reproduzierbarkeit und unterschiedlichen Ablesemodi verglichen. SSO-basierte Polyplexe wurden aus PEI-Polymeren hergestellt, deren Molekulargewicht zwischen 1 bis 3 kDa liegt und die einen unterschiedlichen Grad an Disulfidbrücken aufweisen. Als positive, nicht quervernetzte Kontrollen wurden verzweigtes PEI (BPEI) und Lipid-basiertes handelsübliches Lipofectamine 3000 verwendet. Die kationischen Polymere wurden verwendet, um Luciferase-SSO (LucSSO) oder negative SSO (NegSSO) zu komplexieren, die dann in zwei Konzentrationen, 160 pmol und 80 pmol, für die Behandlung von PECs (zur Untersuchung der Zellviabilität mittels Resazurin-Assay) und HeLa pLuc705-Zellen (zur Untersuchung der Spleißkorrektur mittels Firefly Luciferase Assay) verwendet wurden. In der vorliegenden Studie konnte gezeigt werden, dass mit dem Überstand der polyplexbehandelten Zellen die Zellviabilität gleichzeitig mit der Luciferase Expression der Zellen untersucht werden kann, was eine zeitsparende und empfindliche Multiplex-Methode zur Kombination von Zelllebensfähigkeit und Transfektionsstudien darstellt.
Abstract
(Englisch)
Splice switching oligonucleotides (SSO) can alter pre-mRNA transcripts by interacting with the splicing machinery to restore defective or absent proteins, which would otherwise cause diseases. Cell based in vitro assays are essential tools for the development of these SSO-based RNA targeted therapeutics for studying their transfection efficiency and cell viability profile. Polyethylenimine (PEI) based polymers work efficiently as transfection agents by complexing nucleic acids, like SSOs, and offer diversity in structure and available functionalities. Towards this, the present thesis includes cell-based assays for studying different versions of PEI based SSO polyplexes for transfection efficiency and cell viability profile on human cervical cancer cell line HeLa pLuc705 and primary endothelial cells of porcine origin (PEC). It was important to first optimize resazurin assay for both cell types before examining cytotoxicity of polyplexes. HeLa pLuc705 and PEC were seeded at different cell numbers and resazurin assay was carried out by fluorometric readout of the supernatant. Freshly prepared housemade resazurin solution and commercially available Alamar Blue HS reagent was compared regarding their sensitivity, reproducibility and different modes of reading. SSO-based polyplexes were prepared from different PEI polymers with molecular weights ranging from 1 to 3 kDa and different degrees of disulfide crosslinking. As positive non-crosslinked controls branched PEI 25 kDa (BPEI) and lipid-based commercially available Lipofectamine 3000 were used. The cationic polymers were used to complex luciferase SSO (LucSSO) or negative SSO (NegSSO), which were then used in two concentrations, 160 pmol and 80 pmol for the treatment of PECs (for studying cell viability via resazurin assay) and HeLa pLuc705 cells (for studying splice correction by firefly luciferase assay). In the present study, it could be shown that using the supernatant of polyplex treated cells, cell viability can be simultaneously assayed along with luciferase activity readout from the cells, providing a time-effective and sensitive multiplexed method for combining cell viability with transfection studies.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Polyethylenimine Splice switching Oligonukleotide Zytotoxizität
Schlagwörter
(Englisch)
polyethylenimine splice switching oligonucleotides cytotoxicity
Autor*innen
Stefanie Kaufmann
Haupttitel (Deutsch)
Optimization of multiplexed assays for in vitro splice correction and cytotoxicity
Publikationsjahr
2024
Umfangsangabe
63 Seiten : Illustrationen
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Manfred Ogris
Klassifikationen
35 Chemie > 35.65 Nukleinsäuren ,
44 Medizin > 44.40 Pharmazie. Pharmazeutika
AC Nummer
AC17060183
Utheses ID
69938
Studienkennzahl
UA | 066 | 605 | |