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Epitope mapping of AMP-ADH and NAD-ADH with the aid of adiabatic fast passage nuclear Overhauser enhancement spectroscopy
Andrea Vavrinska
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Robert Konrat
DOI
10.25365/thesis.7804
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29558.00667.518155-4
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Im Kontext dieser Diplomarbeit wurde eine innovative Methode für die Bestimmung der Bindungsaktivität als auch der konformationellen Charakterisierung des Bindungsepitops von Liganden in der Bindungstasche des Proteins implementiert. Die Methode bedient sich eines Analogons der klassischen 1D-NOESY-Spektroskopie, unter Zuhilfenahme eines adiabatischen Inversionspulses (Adiabatic Fast Passage). Die 1D-AFP-NOESY-Sequenz gewährleistet die Detektion des relativen Anteils an direktem und indirektem NOE Transfers, welches während der Relaxationszeit der Kernspins auftritt und determinierend ist für die Bestimmung der Konfiguration des Liganden innerhalb der Bindungskavität des Proteins. Der Anteil an direktem und indirektem NOE Magnetisierungstransfers wird charakterisiert durch die NOE Aufbaukurve während der Relaxationszeit und ist für jeden individuellen Kern im Ligandenmolekül unterschiedlich. Bei einem eindimensionalen NOESY Experiment werden üblicherweise die Protonen des Liganden detekiert. Ligandenprotonen, die sich durch einen starken indirekten NOE Transfer, dem sog. Phänomen der Spin Diffusion auszeichnen, werden sich in der Bindungstasche des Proteins auf der Berührungsfläche zwischen Protein und Ligand anordnen. Im Gegensatz dazu, werden Ligandenprotonen, die wiederum einen vergleichsweise stärkeren direkten NOE Transfer aufweisen, die Position auf der Aussenfläche der Bindungskavität des Proteins einnehmen. In einem zweiten, zum 1D-AFP-NOESY komplementären Screening-Experiment wurde das Prinzip der Sättigungs-transfer-Differenz-NMR-Spektroskopie (STD) eingesetzt und verglichen. Beide Methoden beruhen auf einer Differenzbildung zwischen Sättigungstransfer- und normalem NMR-Spektrum, und resultieren in Spektren, die nur Signale bindender Liganden enthalten. Mit diesem Experiment lässt sich das Bindungsepitop von Liganden leicht bestimmen, da mit dem Protein in direktem Kontakt stehende Ligandenreste intensivere STD-Signale liefern. Das STD-Experiment wurde als 1D-Experiment aufgesetzt, mit dem Proton, als zu detekierenden Kern. Liganden, die reversibel mit der Bindungsdomäne eines Proteins in Wechselwirkung stehen, zeigen charakteristische Relaxations- und Mobilitätsunterschiede, zu den Molekülen, die keine Affinität zum Protein aufweisen. Diese zwei ergänzenden Experimente wurden mit drei verschiedenen Protein-Ligand Komplexen durchgeführt: mit Adenosinmomophosphat (AMP) und dem aus Saccharomyces cerevisiae stammenden Enzyms, der Alkoholdehydreogenase, mit dem Coenzym Nicotinamidadenindinucleotid (NAD) und der Alkoholdehydrogenase, und schließlich mit der Vanillinsäure und dem Transporterprotein, Lipocalin (Q83). Das entscheidende Ergebnis lieferte das Vergleichsexperiment zwischen AMP/ADH und dem Komplex NAD/ADH, welches im AFP-NOESY Experiment den eindeutigen Beweis für eine identische Konformation im Bezug auf die syn/anti Isomerie des N-glykosidischen Bindungswinkels zwischen der Ribose und der Base Adenine, im AMP-ADH als auch im NAD-ADH Komplex lieferte.
Abstract
(Englisch)
A novel assignment method has been employed to determine the binding activity and conformational arrangement of a small-molecule ligand present in incremental excess of a high-molecular-weight receptor. The method applied is an analogon of the classical 1D NOESY experiment, with additional use of an adiabatic inversion pulse. This Adiabatic Fast Passage NOESY (AFP-NOESY) experiment provides an accurate predication about the stereochemical configuration of the ligand molecule inside the binding pocket of the protein. The latter information is based on the NOE build-up curve resulting from the pulse sequence, which is displayed as the sum of two jointly contiguous effects, during the relaxation runtime of the nuclear spins. The two effects involve the direct and indirect NOE magnetization transfer pathway, whose relative contingent for each individual ligand proton holds information about the spherical positioning of the ligand inside the binding cavity of the protein, thus determining its binding epitope. A supplementary experiment introducing the Saturation-Transfer-Difference-Spectroscopy (STD), allows for a means of certification for the newly implemented AFP-NOESY experiment.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
epitope mapping by AFP-NOESY
Schlagwörter
(Deutsch)
Epitop Mapping mit Hilfe von AFP-NOESY
Autor*innen
Andrea Vavrinska
Haupttitel (Englisch)
Epitope mapping of AMP-ADH and NAD-ADH with the aid of adiabatic fast passage nuclear Overhauser enhancement spectroscopy
Paralleltitel (Deutsch)
Epitop Mapping des AMP-ADH und NAD-ADH Komplexes mit Hilfe der AFP-NOESY Spektroskopie
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
126 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Robert Konrat
Klassifikation
35 Chemie > 35.50 Organische Chemie: Allgemeines
AC Nummer
AC08158858
Utheses ID
7037
Studienkennzahl
UA | 490 | | |