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Investigating the mechanism of immunoglobulin M assembly using protein semisynthesis
Leopold Dürrauer
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doktoratsstudium NAWI aus dem Bereich Naturwissenschaften (DissG: Chemie)
Betreuer*in
Christian Friedrich Wilhelm Becker
DOI
10.25365/thesis.75753
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-27977.04076.373133-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Antikörper, auch bekannt als Immunglobuline (Ig), sind essenzielle Bestandteile des menschlichen Immunsystems. Eine besondere Bedeutung kommt hierbei dem multivalenten, polymeren IgM zu, welches besonders in der frühen Phase der Immunantwort des adaptiven Immunsystems auf Pathogene eine entscheidende Rolle spielt. Allgemein bestehen Immunglobuline aus zwei kovalent verbundenen leichten (L) und zwei schweren (µ) Ketten, die µ2-L2-Untereinheiten bilden. Im Fall von IgM werden diese Untereinheiten weiter zu (µ2-L2) Penta- oder (µ2-L2) Hexameren zusammengesetzt, in Abhängigkeit der Gegenwart der sogenannten J-Kette, was zur Bildung eines Komplexes von über 1.200 kDa führt. Bestehende Studien konnten zeigen, dass die Verlängerung der Cµ4-Domäne der µ Kette mit einem 18 Aminosäure-langem C-terminalen Tailpiece (µtp) ausreichend und notwendig für die Bildung von IgM-Hexamern ist, und dass die Bildung einer Disulfidbrücke zwischen C575 von zwei Cµ4tp-Fragmenten eine Voraussetzung für die Assemblage ist. Unser Ziel war es, den zugrundeliegenden Mechanismus der IgM-Dimerisierung durch die Erstellung und Untersuchung von µtp-erweiterten Cµ4-Domänen weiter zu erforschen. Um dieses zu bewerkstelligen, haben wir Strategien für die semisynthetische Produktion von modifizierten Cµ4tp-Domänen entwickelt, um die Einfügung von nicht-proteinogenen Aminosäuren in unsere Konstrukte zu ermöglichen. Wir haben erfolgreich mehrere Cµ4tp-Varianten produziert, die einen p-Benzoyl-L-Phenylalanine Photocrosslinker in ihrem tp tragen. Diese Varianten (L561Bpa, Y562Bpa und V564Bpa) zeigen ein Faltungsverhalten, das mit dem wildtypischen Cµ4tp weitgehend übereinstimmt. Diese könnten es ermöglichen, bisher unbekannte Interaktionsstellen während der IgM-Oligomerisation zu suchen. Zusätzlich präsentieren wir Fortschritte bei der semisynthetischen Darstellung von glykosylierten Cµ4tp-Varianten, einschließlich einer minimal glykosylierten Variante mit einem GlcNAc in Position Asn563 und einer Variante, die ein komplexes Glykan an derselben Position trägt, welche aus Sialylglykopeptid (SGP) gewonnen wurde. Wir zeigen außerdem ein neues Protokoll für die Isolierung von SGP aus Eigelbpulver und diskutieren unsere Ergebnisse und Erfahrungen bei der Durchführung direkter Transglykosylierungsreaktionen unter Verwendung von SGP als Glykanspender.
Abstract
(Englisch)
Antibodies, also known as immune globulins (Ig), are key players in the human immune system. In particular, the multivalent, polymeric IgM represents an early response against pathogens by the adaptive immune system. Generally, immune globulins consist of two covalently linked light (L) and two heavy (µ) chains, that form µ2-L2 subunits. In case of IgM, these subunits are further assembled into (µ2-L2) penta- or (µ2-L2) hexamers depending on the presence or absence of a J chain, resulting in a complex of over 1.200 kDa. Previous studies have shown that extending the Cµ4 domain of µ chain with an 18-aa C-terminal tailpiece (µtp) is sufficient and necessary for the formation of hexamers, and that disulfide bond formation between C575 of two Cµ4tp fragments is a prerequisite for assembly. We aimed to further explore the underlying mechanism of IgM assembly dimerization via creating and investigating µtp-extended Cµ4 domains. To achieve this goal, we have developed strategies for the semisynthetic production of modified Cµ4tp domains to facilitate the incorporation of non-proteinogenic amino acids into our constructs. We successfully produced three Cµ4tp variants, each carrying a p-benzoyl-L-phenylalanine (BPA) photocrosslinkers in a different position of the tp. These variants (L561Bpa, Y562Bpa and V564Bpa) display folding behavior in line with wild-type Cµ4tp and may allow for searching yet unknown interaction sites during IgM assembly. Additionally, we present work toward the semisynthetic production of glycosylated Cµ4tp variants, including a minimally glycosylated variant carrying a GlcNAc in position Asn563 and a variant carrying a glycan derived from sialylglycopeptide (SGP) in the same position. Furthermore, we show a new protocol for isolating SGP from egg yolk powder and discuss our results and experiences performing direct transglycosylation reactions using SGP as glycan donor.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
IgM Semisynthese
Schlagwörter
(Englisch)
IgM semisynthesis
Autor*innen
Leopold Dürrauer
Haupttitel (Englisch)
Investigating the mechanism of immunoglobulin M assembly using protein semisynthesis
Paralleltitel (Deutsch)
Untersuchung des Mechanismus der Immunoglobulin M Zusammensetzung mittels Proteinsemisynthese
Publikationsjahr
2024
Umfangsangabe
179 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Henning Mootz ,
Christopher Gerner
AC Nummer
AC17179494
Utheses ID
70452
Studienkennzahl
UA | 796 | 605 | 419 |