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Early B cell development analyzed by new mouse molecular genetic tools
Anna Sales Fedl
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium Naturwissenschaften (Lebenswiss.): Molekulare Biologie
Betreuer*in
Meinrad Busslinger
DOI
10.25365/thesis.81209
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-16976.71904.819725-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
E2A, Ebf1, Pax5, sowie die Mitglieder der Ikaros-Familie Ikaros und Aiolos sind Transkriptionsfaktoren, die für die Entwicklung der B-Zellen von entscheidender Bedeutung sind. Mutationen dieser Transkriptionsfaktoren sind mit B-Zell-spezifischen Krankheiten in Verbindung gebracht worden.
In dieser Studie wurden neue Mausmodelle entwickelt, um die Rolle der fünf Transkriptionsfaktoren für die Entwicklung der B-Zellen im gesunden Zustand und im Zusammenhang mit Krankheiten zu untersuchen.
Mit den derzeit gängigen Methoden lässt sich nicht erfassen, welche Gene direkt und indirekt von einem Transkriptionsfaktor reguliert werden. Als alternativen Ansatz haben wir hier den zielgerichteten Proteinabbau auf der Grundlage des Auxin-induzierbaren Degron-Systems (Aid) adaptiert. In Mäusen, die C- oder N-terminal Aid-getaggte Transkriptionsfaktoren, zusammen mit dem mutierten Adapterprotein Tir1 (Tir1-F74G) exprimierten, konnte der proteasomale Abbau der Transkriptionsfaktoren durch die Behandlung mit dem Auxinderivat 5-Ph-IAA induziert werden. Durch die Kombination von akutem in vivo Proteinabbau mit der Analyse neu generierter Transkripte, konnten wir zum ersten Mal die direkten Zielgene der fünf Transkriptionsfaktoren in den frühen B-Zell Stadien des Knochenmarks identifizieren. Darüber hinaus konnten wir durch die Bestimmung der genomweiten Bindung und der Messung von akuten Veränderungen in der Chromatinzugänglichkeit die regulatorischen Elemente in deren Zielgenen identifizieren. Unsere Ergebnisse zeigen, dass E2A, Ebf1 und Pax5 die meisten Gene eigenständig regulieren und die Genexpression aktivieren, indem sie das Chromatin öffnen. Im Gegensatz dazu sind Ikaros und Aiolos Repressoren, die ihre Gene kooperativ regulieren. Außerdem zeigen wir, dass die fünf Transkriptionsfaktoren zentrale Ereignisse der frühen B-Zellentwicklung regulieren.
Veränderungen des Transkriptionsfaktors PAX5 sind mit der akuten lymphoblastischen B-Zell-Leukämie assoziiert worden. Zu den genetischen Veränderungen gehören unter anderem chromosomale Translokationen, aus denen verschiedene PAX5-Fusionsproteine entstehen. In dieser Studie haben wir ein Mausmodell zum humanen PAX5-JAK2 generiert. PAX5-JAK2 ist ein chimäres Protein, das die C-terminale PAX5-DNA-Bindungsdomäne mit der konstitutiv aktiven JAK2-Kinasedomäne kombiniert. Mäuse, welche PAX5-JAK2 aus dem endogenen Pax5-Lokus exprimierten (Pax5Jak2/+ Mäuse), entwickelten eine aggressive Form von B-Zell-Leukämie, welche von der PAX5-JAK2-DNA-Bindungsdomäne und Kinaseaktivität abhängig war. PAX5-JAK2 agierte nicht als Transkriptionsfaktor, da es nicht in der Lage war, das Pax5-Genexpressionsprogramm zu aktivieren. Stattdessen fungierte es als nukleäre STAT5-Kinase, welche eine hohe nukleäre STAT5-Phosphorylierung aufrechterhielt. Unsere Ergebnisse deuten auf einen Dual-Hit-Mechanismus hin, der einen Verlust der PAX5 Funktion als Transkriptionsfaktor mit der Aktivierung der STAT5-abhängigen Genexpression kombiniert.
Abstract
(Englisch)
Early B cell lymphopoiesis relies on the coordinated activity of the transcription factors E2A, Ebf1, Pax5, and Ikaros family members Ikaros and Aiolos. These transcription factors are essential for B cell development and mutations have been associated with the emergence of B cell malignancies. Here, we have generated new mouse models to investigate their role in early B cell development in health and disease.
Current methods to study the physiological functions of transcription factors fail to capture which genes are directly and indirectly regulated. In this study, we adopted targeted protein degradation, based on the auxin-inducible degron (Aid) system, as an alternative approach. Mice expressing C- or N-terminal Aid-tagged transcription factors, together with the mutated Tir1 adapter protein (Tir1-F74G), facilitated proteasomal degradation of tagged transcription factors upon treatment with the auxin derivative 5-Ph-IAA. By combining acute in vivo protein degradation with nascent transcript analysis, we, for the first time, identified their target genes in pro-B, small pre-B, and immature B cells. Moreover, assessment of genome-wide transcription factor binding and readout of acute changes in chromatin accessibility identified putative regulatory elements at their target genes. Our findings revealed that E2A, Ebf1, and Pax5 predominantly carry out unique functions and act primarily as transcriptional activators by opening chromatin. Conversely, Ikaros and Aiolos are dedicated transcriptional repressors that cooperatively regulate target genes. Additionally, we identified the direct transcriptional control of critical events in early B cell development by the five transcription factors.
Genetic alterations of the B cell lineage-defining transcription factor PAX5 are frequently associated with B cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Alterations prominently feature chromosomal translocations, which give rise to various PAX5 fusion proteins. Here, we generated a mouse model for human PAX5-JAK2, a chimeric protein that combines the C-terminal PAX5 DNA-binding domain with the constitutively active JAK2 kinase domain. Mice expressing PAX5-JAK2 from the endogenous Pax5 locus (Pax5Jak2/+ mice) rapidly developed aggressive B-ALL, which was dependent on PAX5-JAK2 DNA-binding and kinase activity. PAX5-JAK2 did not act as a transcription factor, as it was unable to activate the Pax5 gene expression program and instead served as a nuclear STAT5 kinase, sustaining high levels of STAT5 phosphorylation. Our findings suggest a "dual hit" B-ALL-initiating mechanism of PAX5-JAK2, combining loss of PAX5 with the activation of the STAT5-dependent gene expression program.
Together, the work presented here showcases the usefulness of mouse models in deciphering normal and pathophysiological mechanisms of gene regulation.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Immunologie B-Zellen Zielgerichteter Proteinabbau
Schlagwörter
(Englisch)
Immunology B cells Targeted protein degradation
Autor*innen
Anna Sales Fedl
Haupttitel (Englisch)
Early B cell development analyzed by new mouse molecular genetic tools
Publikationsjahr
2024
Umfangsangabe
221 Seiten : Illustrationen, Diagramme
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Anna Christina Obenhauf ,
Marta Rizzi
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC17249880
Utheses ID
71051
Studienkennzahl
UA | 794 | 685 | 490 |