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Evaluation of a qPCR-based telomere sequence variant detection assay on several ALT model cell lines
Nicolai Valentin Hörstke
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Klaus Holzmann
DOI
10.25365/thesis.75737
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-17840.65137.113377-9
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die alternative Verlängerung der Telomere (ALT) ist ein Telomererhaltungsmechanismus (TMM), der bei etwa 10-15 Prozent der Krebsarten vorliegt. ALT führt zu heterogenen Telomerlängen und Variantenwiederholungen (NCTRs) in den distalen Telomerregionen, was zu einer verringerten Shelterinfunktion führt. Bislang wurden diese Varianten hauptsächlich durch Sequenzierung des gesamten Genoms (WGS) nachgewiesen. In dieser Studie wurde ein qPCR-basierter Nachweis von Telomervarianten evaluiert. Zelllinienmodelle mit definiertem TMM wurden mit C-Circle-Assays (CCA) und quantitativem ALT-FISH auf ihre ALT-Aktivität hin überprüft, welche bei fünf von sechs ALT-Zelllinien gezeigt wurde. Außerdem wurde das das Vorhandensein von NCTRs in C-Circles, indem der Variantennachweis-Assay auf die Produkte der CCAs angewendet wurde. Im Anschluss wurden Telomersequenzvarianten (TCAGGG, TGAGGG, TAAGGG) durch einen qPCR-basierten Assay sowie durch quantitative FISH (nur TCAGGG und TGAGGG) nachgewiesen. Der Vergleich der Ergebnisse untereinander und mit publizierten WGS-Daten zeigte statistisch signifikante, starke Korrelationen zwischen qPCR- und WGS-Daten für die TCAGGG- und TGAGGG-Varianten. Zusätzlich wurde die Fähigkeit des Assays Cluster mit mehreren Variantenwiederholungen zu erkennen an verschiedenen TCAGGG-Variantenoligonukleotiden getestet sowie seine Spezifität ermittelt, indem er an mit für TCAGGG- und TGAGGG-Varianten spezifischen Restriktionsenzymen verdauten DNA angewandt wurde. Bei diesen Experimenten wurde die abnehmende Nachweisbarkeit mit zunehmender Clusterlänge sowie, die zunehmende Nachweisbarkeit von Varianten, die näher am 5'-Ende der von Primern flankierten Region liegen und eine signifikante Verringerung der TGAGGG-, aber nicht der TCAGGG-Häufigkeit nach dem Restriktionsverdau gezeigt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass NCTRs durch qPCR mit einer hohen Sensitivität und Spezifität in validierten ALT-Zelllinien nachgewiesen werden können. Dies ermöglicht den potenziellen Einsatz von qPCR-basierten NCTR-Detektionsmethoden im klinischen Screening.
Abstract
(Englisch)
Alternative lengthening of telomeres (ALT) is a telomere maintenance mechanism (TMM) used by around 10-15 percent of cancers. ALT leads to heterogeneous telomere lengths and variant repeats (NCTRs) in telomeres’ distal regions reducing shelterin functions. For now, these variants have been mainly detected by whole genome sequencing (WGS). In this study, a qPCR-based assay for NCTR-detection was evaluated. Cell lines with a defined TMM state were validated for ALT activity by C-circle assays (CCA) and quantitative ALT-FISH confirming the ALT activity of five out of six ALT cell lines. Additionally, the presence of NCTRs in C-Circles was shown by applying the variant detection assay to the CCA-products. Subsequently, telomere sequence variants were detected by a qPCR-based assay and quantitative FISH. Comparisons of the results with each other and with published WGS data showed statistically significant, strong correlations between qPCR and WGS data for the TCAGGG and TGAGGG variants. Furthermore, the assay’s ability to detect clusters of multiple variant repeats and its specificity was assessed by applying it to different TCAGGG variant-oligonucleotides and to DNA digested by TCAGGG and TGAGGG variant-specific restriction enzymes, respectively. These experiments showed decreasing detectability of longer clusters and increasing detectability of variants closer to the 5’ end of the primer-flanked region and a significant decrease of TGAGGG- but not of TCAGGG-variants upon digestion. This thesis shows that NCTRs can be detected by qPCR with a high sensitivity and specificity in validated ALT cell lines. This enables the potential usage of qPCR-based NCTR-detection assays in clinical screening.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Krebs Telomerbiologie Alternative Verlängerung der Telomere Telomererhaltungsmechanismus
Schlagwörter
(Englisch)
Cancer Telomerebiology Alternative lengthening of telomeres Telomere maintenance mechanism
Autor*innen
Nicolai Valentin Hörstke
Haupttitel (Englisch)
Evaluation of a qPCR-based telomere sequence variant detection assay on several ALT model cell lines
Paralleltitel (Deutsch)
Evaluation eines qPCR-basierten Telomersequenzvariantendetektionsassays an einigen ALT Modellzelllinien
Publikationsjahr
2024
Umfangsangabe
169 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Klaus Holzmann
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC17177931
Utheses ID
71092
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |