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MAP1B and S-nitrosylation in axon guidance, glial cell function and neurodegeneration

Luise Descovich

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Friedrich Propst

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URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-29206.69965.917861-9

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Die Aktivierung der neuronalen Stickoxidsynthase (nNOS) in dorsalen Wurzelganglion (DRG) Neuronen führt zu Axonretraktion die abhängig von MAP1B S Nitrosylierung ist1. Um zu untersuchen ob dieser Mechanismus auch in klassischen Signaltransduktionswegen der Axonführung wichtig ist, erforschte ich die Rolle von MAP1B und NO in den Netrin-1- und Semaphorin3A-Signaltransduktionswegen. Netrin-1 wird an der Mittellinie des sich entwickelnden zentralen Nervensystems exprimiert und kann, je nach extrazellulärer Umgebung, entweder anziehend oder abstossend auf Nervenzellen wirken. Zum Beispiel wurde gezeigt, dass die Verfügbarkeit von Laminin bestimmt ob Netrin-1 attraktiv oder repulsiv agiert2. Ausserdem scheint MAP1B wichtig für die korrekte Interpretierung des attraktiven Netrin-1 Signals3 und die Axonführung über die Mittelllinie im Mausvorderhirn4. Bindung von Netrin-1 an seinen Rezeptor induziert einen Kalziumeinstrom welcher eventuell nNOS aktivieren könnte. Im ersten Teil meiner Dissertation erforschte ich die Rolle von nNOS, NO und MAP1B in Netrin-1-Axonführung. Ich analysierte das Verhalten von neuronalen Wachstumskegeln von Wildtyp und MAP1B-/- DRG Neuronen auf Laminin und die morphologischen Veränderungen, sowie die Bildung von intrazellulärem NO nach einer Behandlung mit Netrin-1. Die quantitative Analyse zeigte, dass Netrin-1 in Wildtyp sowie in MAP1B-/- DRG Neuronen einen signifikanten Anstieg in Axonretraktion hervorruft, was wiederum annehmen lässt, dass MAP1B im repulsiven Netrin-1 Signalweg keine Rolle spielen dürfte. Nach der Behandlung mit Netrin-1 wurde in Wildtyp und MAP1B-/- DRG Neuronen ein starker Anstieg in der Produktion von NO beobachtet. Die stärkste Konzentration an NO war in kollapierten Wachstumskegeln und zurückgezogenen Axonen zu sehen. Das weist darauf hin, dass durch den Netrin-1 induzierten Kalziumeinstrom eine NOS aktiviert wird. Mithilfe spezifischer NOS-Inhibitoren konnte ich zeigen, dass in Wildtyp DRG Neuronen nNOS und in MAP1B-/- DRG Neuronen endotheliale NOS (eNOS) durch Netrin-1 aktiviert werden. Dieser Unterschied kommt daher, dass in MAP1B-/- DRG Neuronen nNOS-Expression stark hinunterreguliert ist. Diese Resultate deuten auf eine neue Rolle von nNOS und NO in Netrin-1 Axonführung hin. Die NO-Synthese kann zwei Effekte bewirken: zum Ersten die S-Nitrosylierung von Protein oder die Aktivierung des sGMP Signalweges. Da meine Resultate zeigen, dass die S-Nitrosylierung von MAP1B nicht essenziell im repulsiven Netrin-1 Signalweg ist, untersuchte ich den cGMP Signalweg etwas genauer. Dafür verwendete ich spezifische Inhibitoren für soluble Guanylyl Cyclase (sGC), ODQ und LY83583. Die Inhibierung von sGC verhinderte nicht die Netrin-1 induzierte Axonretraktion. Stattdessen führte die Inhibierung von sGC per se zu einer rapiden, MAP1B-abhängigen Axonretraktion. Dieses Resultat weist darauf hin, dass ein negativer Feedbackmechanismus, der zuvor beschrieben wurde5, in der Tat in DRG Neuronen auftritt. Demnach bewirkt NO die cGMP-Synthese, diese aktiviert PKG welche nNOS phosphoryliert und deaktiviert. Durch die Inhibierung der sGC wird dieser negative Feedbackmechanismus ausgeschaltet und nNOS bleibt aktiv und synthetisiert weiterhin NO, welches letztendlich zu MAP1B-abhängiger Axonretraktion führte. Übereinstimmend damit konnte ich zeigen, dass sGC Inhibitor-induzierte Axonretraktion nicht in MAP1B-/- Neuronen auftritt und, dass die Retraktion in Wildtypneuronen durch NPA verhindert werden kann, welche die Inhibierung von nNOS durch PKG nachahmt. Um herauszufinden, ob NO Synthese auch im Semaphorin3A Signalweg eine Rolle spielt, kultivierte ich Explantate von Hippocampus und DRGs in Wachstumsmedium welches Semaphorin3A und/oder NOS Inhibitoren enthielt. Diese Experimente gaben einen klaren Hinweis darauf, dass NO in der Tat wichtig für den repulsiven Semaphorin3A Mechanismus ist. Im zweiten Teil meiner Dissertation interessierte ich mich für die Rolle von MAP1B in Oligodendrozyten. MAP1B Expression geht der terminalen Differenzierung dieser Zellen voran und wurde in Oligodendrozyten beobachtet, die kurz davor stehen, Axone zu myelinisieren6. Es wurde mehrmals postuliert, dass NO in Oligodendrozytenschädigungen und in der Demyelinisierung im Laufe von Krankheiten wie Multipler Sklerose involviert ist7. Daher stellt sich die Frage, ob MAP1B als Mediator der NO-Toxizität in diesen Zellen dienen könnte. Ausserdem wurde gezeigt, dass MAP1B für den Transport von mRNA in DRG Neuronen wichtig ist. Da der mRNA-Transport zur Zellperipherie essenziell für die Etablierung einer Myelinschicht ist, wollte ich die Wichtigkeit von MAP1B in diesen Zellen untersuchen. Überraschenderweise differenzierten MAP1B-/- Zellen in vitro normal. Oligodendrozyten zeigten auch keine Reaktion auf eine Behandlung mit hochkonzentrierten NO-Donoren. Andererseits bewirkte die Stimulierung eines Kalziumeinstroms, welcher NOS aktiviert, einen Kollaps des Zytoskeletts. Dieser Kollaps konnte teilweise durch die Inhibierung von nNOS in Wildtyp und eNOS in MAP1B-/- Zellen verhindert werden. Ich nehme daher an, dass in Oligodendrozyten, wie in Neuronen, ein Unterschied im NOS Expressionsschema zu finden ist. Ausserdem zeigen die Resultate, dass NOS und NO in der Tat toxisch auf Oligodendrozyten wirken und das Zytoskelett beeinflussen.

Abstract

(Englisch)

Activation of neuronal nitric oxide synthase (nNOS) in dorsal root ganglia (DRG) neurons leads to axon retraction dependent on S-nitrosylation of microtubule associated protein 1B (MAP1B). These findings raised the question whether this mechanism is involved in classical axon guidance signaling, for example in response to the guidance cues netrin-1 and semaphorin3A. Netrin-1 is expressed at the midline of the developing central nervous system and can act as attractive or repulsive cue, depending on the environmental context. The absence or presence of laminin in the extracellular matrix determines whether netrin-1 triggers attraction or repulsion, respectively. On the other hand, it has been shown that MAP1B is necessary for the proper transduction of the attractive netrin-1 signal and for axon guidance across the midline in the murine forebrain. Netrin-1 guidance involves calcium influx and could lead to nNOS activation. In the first part of my PhD thesis, I investigated the role of nNOS, NO and MAP1B in netrin-1 guidance. I analyzed growth cone behaviour of wild-type and MAP1B-/- DRG neurons on laminin and monitored the morphological changes upon netrin-1 treatment and intracellular NO synthesis. The analysis of the response of wild-type and MAP1B-/- DRG neurons to netrin-1 revealed a significant increase of retracted neurons after the incubation with netrin-1 in both cell types suggesting that MAP1B is not relevant for repulsive netrin-1 signaling in DRG neurons. Moreover, after netrin-1 treatment, a striking increase in the production of intracellular NO could be observed in wild-type and MAP1B-/- DRG neurons. The highest concentration of NO was seen in the collapsed growth cones of retracted axons. This result suggests that the Ca2+ influx induced by netrin-1 activates a NOS. With the help of specific NOS inhibitors I could show that in wild-type DRG neurons nNOS was activated downstream of netrin-1, whereas in MAP1B-/- DRG neurons it was endothelial NOS (eNOS). This difference in the downstream target of netrin-1 was due to a greatly reduced expression of nNOS in MAP1B-/- DRG neurons. These results demonstrate a novel role for nNOS and NO in netrin-1 mediated axon guidance. The production of NO following netrin-1 treatment can affect two possible downstream effectors: protein-S-nitrosylation or the cGMP pathway. Since my results indicate that S-nitrosylation of MAP1B is probably not essential for netrin-1 repulsion, the cGMP pathway was investigated in more detail. For this purpose the specific inhibitors for soluble guanylyl cyclase (sGC), ODQ and LY83583 were used. However, the inhibition of sGC did not prevent netrin-1 induced retraction. Instead, inhibitions of sGC per se lead to rapid, MAP1B-dependent axon retraction and an increase in NO synthesis. This indicates that a negative feedback mechanism, which was previously suggested by results obtained in vitro, is indeed at work in DRG neurons. According to this model, NO triggers cGMP synthesis, which in turn will activate cGMP-dependent kinase (PKG) to phosphorylate and thereby inactivate nNOS. By inhibiting sGC, this negative feedback mechanism is shut down and nNOS continues to produce NO which will finally lead to MAP1B dependent axon retraction. Consistent with this model, I could show that sGC inhibitor induced axon retraction is not observed in MAP1B-/- Neurons and can be prevented in wild-type neurons by NPA, which mimicked inhibition of nNOS by PKG. In order to analyze whether NO might also play a role in the semaphorin3A pathway, I grew explants from hippocampus and DRGs in media supplemented with semaphorin3A in the presence of NOS inhibitors. I obtained strong evidence that NO production might indeed be involved in repulsive semaphorin3A signaling. In the second part of my PhD thesis I was interested in the role of MAP1B in oligodendrocytes. MAP1B expression precedes terminal differentiation of and was observed in oligodendrocytes that initiate ensheathment of axons6. NO has been postulated to play a role in oligodendrocyte damage and myelin loss in multiple sclerosis7. This raised the question whether MAP1B might be a mediator of the highly toxic effect of NO to oligodendrocytes. Moreover, it was suggested that MAP1B plays a role in the transport of mRNA in DRG neurons. As the transport of mRNAs to the cell periphery is essential for the establishment of myelin bearing sheaths during terminal oligodendrocyte differentiation, I investigated the role of MAP1B in these cells. Surprisingly, in vitro oligodendrocyte differentiation was normal in MAP1B-/- cells. Moreover, oligodendrocytes did not show any reaction when treated with NO donors at high concentrations suggesting a lower susceptibility to NO than expected. In contrast, stimulation of calcium influx in oligodendrocytes triggered a NOS-dependent collapse of the cytoskeleton. This collapse could be partially prevented by inhibition of nNOS in wild-type and eNOS in MAP1B-/- cells suggesting that in oligodendrocytes, as in neurons, lack of MAP1B changes the NOS expression pattern. These results show that NOS and NO can indeed be toxic to oligodendrocytes, affecting their cytoskeleton.

Autor*innen

Luise Descovich

Haupttitel (Englisch)

MAP1B and S-nitrosylation in axon guidance, glial cell function and neurodegeneration

Paralleltitel (Deutsch)

MAP1B und S-Nitrosylierung in Axonführung, Gliazellfunktion und Neurodegeneration

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

169 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Johannes Nimpf ,

Fatiha Nothias

Klassifikation

42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie

AC Nummer

AC07806055

Utheses ID

7121

Studienkennzahl

UA | 091 | 490 | |

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