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Characterization of the Hfq binding antisense RNA as-htrG-cca
Peter Hajdusits
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Renee Schroeder
DOI
10.25365/thesis.7925
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29763.29774.213064-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Cis antisense RNAs liegen gegenüber von Protein kodierenden Genen am entgegengesetzten DNA Strang und wirken auf ihre Ziel-RNAs durch Basenpaarung. Die bisher bekannten bakteriellen cis antisense RNAs sind zwischen 50 und 300 Nukleotide lang. Ihre maßgebliche Rolle widerspiegelt sich in der post-transkriptioneller Inhibition der Funktionen ihrer Ziel-RNAs. Diese Inhibition kann einen positiven oder einen negativen Effekt auf fundamentale Prozesse wie Transkription, Translation oder mRNA Stabilität haben.
Durch ein genomic SELEX (engl. für: Systematische Evolution von Liganden durch exponentielle Anreicherung) Verfahren für RNAs, welche das Protein Hfq mit einer hohen Spezifität binden, konnten im Bakterium Escherichia Coli unter anderem 85 cis antisense RNA Fragmente identifiziert werden.
Für weitere Untersuchungen wählte ich die Hfq bindende cis antisense RNA htrG-cca, welches gegenüber der Gene htrG und cca liegt. Das bakterielle Gen cca kodiert für das Enzym tRNA-Nukleotidyltransferase, welches die 5' Enden der Transfer-RNA (tRNA) repariert. Über htrGs Funktion ist bisher nichts Konkretes bekannt.
Das Ziel meiner Diplomarbeit war es, die cis antisense RNA as-htrG-cca zu untersuchen und zu charakterisieren. In einem ersten Experiment, welches auf die Technik 'Reverse Transkriptase Polymerase Kettenreaktion' (RT-PCR) basiert, konnte ich die 5' und die 3' Enden des zu untersuchenden Transkripts eingrenzen. Die errechnete Distanz zwischen den zwei Enden war mindestens 2205 Nukleotide. Erstaunlicherweise hat das Resultat eines zweiten Experiments - bei dem ich die RNAs durch 3' zu 5' Ligation zirkularisiert habe - ergeben, dass auf demselben Genlokus mehrere, jedoch kürzere antisense Transkripte liegen, die alle unterschiedliche Längen haben. Um aber verlässlichere Ergebnisse über die Länge und Quantität von as-htrG-cca zu sammeln, habe ich einen Northern Blot mit sequenz-spezifischen Sonden durchgeführt. Zwei Sonden waren spezifisch für das sens Transkript und zwei für das antisense Transkript. Dadurch wurde ein einzelnes, 1200nt langes antisense Transkript gefunden, welches nur in logarithmischen Zellen exprimiert wird. Weiters konnte ich die tatsächliche Länge der htrG mRNA bestätigen. Diese war ~900 Nukleotide lang und wies eine 170nt lange 3' untranslatierte Region (UTR) auf, welche bisher nicht bekannt war. Sowohl das sens, als auch das antisense Transkript sind niedrig exprimiert.
Die Länge der Transkripte betreffend würde ich die Unstimmigkeiten in den unterschiedlichen Untersuchungsmethoden folgendermaßen deuten: auf dem htrG-cca Lokus ist ein 1200nt langes Transkript exprimiert, welches in ausreichender Konzentration vorliegt um durch ein Northern Blot Verfahren detektiert zu werden. Zugleich gibt es mehrere, niedrig exprimierte RNAs mit unterschiedlichen Längen, welche man nur durch die hochempfindliche RT-PCR Methode nachweisen kann.
Zusammenfassend konnte ich die antisense RNA as-htrG-cca erfolgreich beschreiben und charakterisieren. Ihre ~1200nt Länge und der Beweis, dass sie tatsächlich auf dem antisense Strang exprimiert wird, waren die wichtigsten Erkenntnisse meiner Arbeit. Die Neuheit dieser Resultate war, dass bis dato keine so große cis antisense RNA bekannt war. Dies könnte ein Indiz für eine neue Gruppe von 'großen cis antisense RNAs' sein.
Abstract
(Englisch)
Cis antisense RNAs are encoded opposite of protein coding genes and they act on their target RNAs via base-pairing. In bacteria, the already known cis-as-RNAs are between 50nt and 300nt long and their major role is post transcriptional inhibition of the target RNA's functions. This could have a positive or a negative effect on fundamental cellular processes like transcription, translation or mRNA stability.
A genomic SELEX for RNAs that bind Hfq with high specificity successfully identified 85 cis antisense RNA fragments in the bacterium Escherichia Coli. For further investigation, I chose the Hfq binding cis antisense RNA htrG-cca, lying opposite to the genes htrG and cca. The bacterial cca gene encodes the enzyme tRNA-nucleotidytransferase which repairs the 3' terminal ends of transfer RNAs (tRNAs) whereas htrG's function is only speculative yet.
The aim of my thesis was to analyze and characterize the cis antisense RNA as-htrG-cca. In a first experiment, based on Reverse Transcriptase PCR (RT-PCR), I narrowed down the 5' and 3' ends of the investigated transcript. The calculated distance between the two ends was at least 2205nt. Surprisingly, the outcome of a second experiment in which I circularized the RNA by head to tail ligation, suggested the existence of many shorter antisense transcripts at the same locus all with varying length. To collect more reliable data regarding the length and abundance of as-htrG-cca, I performed a northern blot with sequence specific probes. Two probes were specific for the antisense and two for the sense transcripts. Thereby I identified a single 1200nt long antisense transcript, expressed in cells grown until logarithmic phase. Additionally I could confirm the actual length of the htrG mRNA, which was ~900nt long and hence also the hitherto unknown length of its ~170nt long 3' UTR. Both, the antisense as well as the sense transcripts were low abundantly expressed. As a possible explanation for the discrepancies of the achieved results, concerning the transcript's length I would assume that there is one 1200nt long antisense RNA which is sufficiently abundant to be recognized with northern blot. At the same time, there are many low abundant RNAs of different length at the same locus, only detectable with the highly sensitive RT-PCR based methods.
Concluding my abstract, I could successfully characterize the cis antisense RNA as-htrG-cca. Its ~1200 nt length and the proof that it is expressed from the antisense strand were the key findings of my thesis. The novelty of these results was that until now there was no such huge cis antisense RNA identified. This is an evidence for a new group of long cis antisense RNAs.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
noncoding RNAs cis antisense RNAs SELEX
Schlagwörter
(Deutsch)
nichtkodierende RNAs cis antisense RNAs SELEX
Autor*innen
Peter Hajdusits
Haupttitel (Englisch)
Characterization of the Hfq binding antisense RNA as-htrG-cca
Paralleltitel (Deutsch)
Charakterisierung der Hfq bindenden antisense RNA as-htrG-cca
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
103 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Renee Schroeder
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC08117958
Utheses ID
7144
Studienkennzahl
UA | 490 | | |