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Exploration of disease variants in Kir channels elucidates gating mechanisms and opens new avenues for drug repurposing
Theres Eva Friesacher
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doktoratsstudium Naturwiss.(Lebenswiss.): Pharmazie
Betreuer*in
Anna Weinzinger
DOI
10.25365/thesis.76325
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30111.85436.683869-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Einwärtsgerichtete K+ (Kir) Kanäle sind essenzielle Regulatoren des Ruhemembranpotenzials und spielen eine integrale Rolle in vielen physiologischen Prozessen. Wie andere Kaliumkanäle ermöglichen Kirs eine selektive und effiziente Leitung von K+ Ionen über die Zellmembran. Kirs werden in sieben Familien (Kir 1-7) eingeteilt, die homo- und heterotetramere Komplexe bilden. Im Allgemeinen werden Kir Kanäle durch das endogene Lipid Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) aktiviert. GIRKx (Kir3.x)-Kanäle werden zusätzlich durch die Gβγ-Untereinheit des G-Proteins reguliert. Kir6.x Kanäle sind ATP-sensitiv und bilden Komplexe mit Sulfonylharnstoffrezeptor (SUR)-Untereinheiten, die als KATP-Kanäle bekannt sind. Das Keppen-Lubinsky-Syndrom (KPLBS) ist eine seltene Krankheit, die durch Mutationen im und hinter dem Selektivitätsfilter (SF) von GIRK2 verursacht wird. Betroffene leiden unter einer Vielzahl schwerwiegender Symptome, wie generalisierte Lipodystrophie und Hypertonie. Elektrophysiologische Experimente zeigen, dass die KPLBS-Mutation G154S zu konstitutiv offenen Kanälen führt, die nicht selektiv sind und weder durch Ba2+ inhibiert, noch mit Gβγ aktiviert werden können. In MD-Simulationen führt die Mutation zu neuen Wasserstoffbrückenbindungen in und hinter dem SF, was zu einer erhöhten Flexibilität des SF, dem Verlust der Selektivität und Wasserdiffusion in die SF-Region führt. In Übereinstimmung mit funktionellen Daten zeigen unsere Simulationen eine Kopplung zwischen dem SF und der Gβγ-Bindungsstelle, was die mutationsbedingte Unempfindlichkeit gegenüber Gβγ erklärt. Darüber hinaus postulieren wir ein bisher unbekanntes Merkmal der GIRK Regulierung, die durch eine Steuerung der SF-Leitfähigkeit durch Gβγ gekennzeichnet ist. Neben KPLBS werden Kir Fehlfunktionen mit mehreren anderen seltenen Krankheiten in Verbindung gebracht. Aufgrund ihrer geringen Prävalenz und der Vielfalt der zugrundeliegenden genetischen Defekte und der damit verbundenen Phänotypen, stellen seltene Krankheiten eine Herausforderung für konventionelle Arzneimittelentwicklungsprozesse dar. Eine interessante Alternative ist das „Repurposing“ von Arzneimitteln, bei der die Off-Target-Aktivitäten bestehender Arzneimittel zur Behandlung von Krankheiten genutzt werden, die nicht der ursprünglichen Wirkstoffindikation entsprechen. Das zugelassene Medikament Ethosuximid (ETX) inhibiert GIRK und ist daher ein vielversprechender Kandidat für die Behandlung von Krankheiten, die durch Mutationen in diesen Kanälen ausgelöst werden. Wir zeigen, dass die Inhibierung allosterisch ist und durch eine Abhängigkeit von Gβγ und der Zusammensetzung der Untereinheiten gekennzeichnet ist. Elektrophysiologie Experimente und MD-Simulationen belegen, dass ETX nahe dem Kir- Aktivator PIP2 bindet, was die Schließung des Helix Bundel Crossing (HBC)-Gates bewirkt. Wir identifizieren außerdem einen allosterischen Pfad, der der Kanalhemmung zugrunde liegt, und die ETX-Bindungsstelle und das HBC-Gate verbindet. Gain-of-Function-Mutationen in KATP-Komplexen, die aus Kir6.2 und SUR1 bestehen, verursachen seltene Krankheiten, die als DEND-Syndrom und in weniger schwerwiegende Fällen als iDEND-Syndrom bekannt sind. Ein üblicher therapeutischer Ansatz zur Behandlung dieser Krankheiten beruht auf der Hemmung der überaktiven KATP Kanäle mit Sulfonylharnstoffen (SUs), die die überaktive KATPs allosterisch durch Bindung an die SUR- Untereinheiten hemmen. Mehrere Mutanten, darunter Kir6.2Q52R und Kir6.2L164P, sind jedoch unempfindlich gegenüber dieser allosterischen Inhibierung. Darüber hinaus sind SUs nur begrenzt in der Lage die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden, sodass sie bei den meisten DEND- und iDEND-Patienten keine Linderung der neurologischen Symptome bewirken. Daher besteht ein Bedarf an alternativen Therapeutika, die die Blut-Hirn-Schranke überwinden und SU- resistente KATP Mutanten wirksam hemmen. Wir zeigen, dass das zugelassene Medikament Betaxolol Kir6.2Q52R oder Kir6.2 Kanäle mit einer μM Affinität inhibiert und in der Kanalpore bindet. Dieser Wirkmechanismus unterscheidet BXL von SUs und macht es zu einem vielversprechenden Ausgangspunkt für die Entwicklung von Therapieansätzen für SU-resistente DEND- und iDEND-Mutationen. Wir zeigen außerdem, dass die synthetischen Prostaglandine Travoprost und Latanoprost wildtyp- (wt) und pathogene Kir6.2L164P-Kanäle hemmen. Coarse-grained MD-Simulationen prognostizieren mehrere Prostaglandinbindungscluster auf den SUR-Untereinheiten, was auf eine allosterische Hemmung von KATP durch diese Verbindungen hindeutet. Unsere Ergebnisse bieten erste Einblicke in die Inhibierung von KATPs durch Prostaglandine und zeigen das Potenzial dieser großen Substanzklasse für Drug Repurposing im Zusammenhang mit KATP-Kanalopathien.
Abstract
(Englisch)
Inwardly rectifying K+ (Kir) channels are essential regulators of the resting membrane potential. They play integral roles in many physiological processes, such as insulin release and muscle and cognitive function. Like other potassium channels, Kirs facilitate a highly selective and rapid K+ conduction. Kir channels can be classified into seven families (Kir 1-7), which form homo- and heterotetrameric complexes. In general, all Kirs are activated by the endogenous lipid phosphatidylinositol-(4,5)-bisphosphate (PIP2). GIRKx (Kir3.x) channels are additionally regulated by the βγ subunit of the G-protein, while Kir6.x channels are ATP-sensitive and form complexes with sulfonylurea receptor (SUR) subunits known as ATP-sensitive potassium (KATP) channels. The Keppen-Lubinsky syndrome (KPLBS) is a rare disease caused by mutations in and behind the GIRK2 selectivity filter (SF). It is characterized by an array of severe symptoms, including generalized lipodystrophy, hypertonia, and delayed psychomotor development. Electrophysiology experiments revealed that the KPLBS mutation G154S leads to constitutively open channels that are non-selective and insensitive to Gβγ activation and Ba2+ block. In MD simulations, the mutation induces novel hydrogen bonds in and behind the SF, causing increased SF flexibility, water diffusion into the SF region, and a concomitant loss of K+ selectivity. In line with functional data, our simulations reveal a coupling between the SF and the Gβγ binding site, explaining the mutation-induced insensitivity to Gβγ. We further propose a new feature of GIRK regulation characterized by an influence of Gβγ binding on gating modulation at the SF. Besides KPLBS, Kir malfunction is linked to several other rare diseases. Due to their low prevalence and the variety of underlying genetic defects and associated phenotypes, rare diseases often challenge conventional drug design pipelines. Drug repurposing is an attractive alternative, where off-target activities of existing drugs are used to treat conditions different from the compounds’ original indication. The approved drug ethosuximide (ETX) is known to inhibit GIRK channels and is, therefore, a promising drug repurposing candidate to target diseases linked to gain-of-function (GoF) GIRK mutations. We identified inherent characteristics of the inhibition, including allosterism, Gβγ sensitivity, and dependency on the GIRK subunit composition. Corroborated by electrophysiology experiments, μs-long MD simulations disclose ETX binding close to the Kir activator PIP2, leading to the closing of the helix bundle crossing (HBC) gate. Using network analysis, we further identify an allosteric pathway underlying channel inhibition that connects the drug binding site with the HBC gate. GoF mutations in KATP complexes composed of Kir6.2 and SUR1 underlie rare channelopathies known as the developmental delay, epilepsy, and neonatal diabetes (DEND) syndrome and the less severe intermediate DEND (iDEND) syndrome. These disorders are commonly treated with sulfonylureas (SUs) that inhibit overactive KATPs allosterically by binding to the SUR subunits. However, several mutants, including Kir6.2Q52R and Kir6.2L164P, are insensitive to this allosteric inhibition. Moreover, SUs have a limited capacity to cross the blood-brain barrier (BBB) and, therefore, fail to alleviate the neurological symptoms in most DEND and iDEND patients. This raises the need for alternative therapeutics that cross the BBB and effectively inhibit SU-resistant mutant channels. We show that the approved drug betaxolol (BXL) inhibits Kir6.2Q52R and Kir6.2L164P in the μM range. Classical and coarse-grained (cg) MD simulations indicate that the drug plugs the channel pore. This mechanism of action (MOA) sets BXL apart from SUs and makes it a promising starting point for developing therapeutic approaches for SU-resistant DEND and iDEND mutations. We further demonstrate that the synthetic prostaglandins travoprost and latanoprost inhibit wild-type (wt) and pathogenic Kir6.2L164P channels. Cg MD simulations predict several prostaglandin binding clusters on the SUR subunits, suggesting an allosteric inhibition of Kir6.2 channels by these compounds. Our findings provide first insights into the interplay between KATPs and prostaglandins and show the potential of this large compound class for drug repurposing in the context of KATP channelopathies.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Moleküldynamiksimulation Einwärstgerichteter Kaliumkanal Seltene Krankheiten Drugrepurposing
Schlagwörter
(Englisch)
Molecular dynamic simulation Potassium channels Rare diseases Drug repurposing
Autor*innen
Theres Eva Friesacher 
Haupttitel (Englisch)
Exploration of disease variants in Kir channels elucidates gating mechanisms and opens new avenues for drug repurposing
Publikationsjahr
2024
Umfangsangabe
x, 176 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Carmen Domene ,
Ulrich Zachariae
Klassifikation
44 Medizin > 44.38 Pharmakologie
AC Nummer
AC17249342
Utheses ID
71930
Studienkennzahl
UA | 796 | 610 | 449 |