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Expression of melatonin receptor MT-1 in the BeWo choriocarcinoma cell line
Mehdi Ramezanian
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Walter Jäger
DOI
10.25365/thesis.8014
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29251.76431.187566-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Hintergrund: Melatonin (MT), das “Hormon der Finsternis”, wird während der Nacht von der Zirbeldrüse sezerniert. Nach seiner Verteilung in Körperflüssigkeiten und Geweben übt es eine Vielfalt von Funktionen aus, die durch zwei G-Protein-gekoppelte Membran-Rezeptoren, MT1 and MT2, vermittelt werden. MT kann z.B. chronobiotisch wirken, Schlaf fördern, immunmodulatorische und onkostatische Effekte ausüben. MT beeinflusst auch die Reproduktion, und bewirkt eine Synchronisation der Reproduktion mit den Umweltbedingungen bei Tieren. Über die Plazenta gelangt MT zum Föten und vermittelt ihm so wichtige photoperiodische Informationen. Schließlich beeinflusst MT über seine Rezeptoren auch die Entwicklung von plazentaren Trophoblasten sowie deren Hormonproduktion. Diese Funktionen wurden aber bis dato nicht systematisch untersucht Ziel: Um Untersuchungen über die Expression und Funktion von MT1 in der Plazenta durchführen zu können, sollte zunächst drei kommerziell verfügbaren anti-MT1 Antikörper, sc-13179, ab-13035 und ab-13036, in Westernblot-Experimenten (WBE) sowie Immunfluoreszenz-Mikroskopie (IFM) in BeWo und anderen Zelllinien mit endogener Expression von MT1 charakterisiert werden. Stabile Transfektionen von BeWo Zellen mit einem HA-markierten humanen MT1 Rezeptor sollte eine MT1-überexpremierende Zelllinie generiert werden, die für weitere Untersuchungen an der Plazenta zur Verfügung steht. Resultate: Alle Antikörper reagierten positiv mit MT1 mRNA expremierenden humanen Zelllinien und Geweben in WBE und IFM, allerdings zeigten die detektierten Proteine sehr unterschiedliche Molekulargewichte. In guter Übereinstimmung mit der Literatur detektierte sc-13179 ein Protein von ungefähr 40 kDa in parentalen BeWo Zellen und plazentaren Gewebsextrakten in WBE, und es zeigte sich eine vor allem intrazelluläre Lokalisation von MT1 in BeWo Zellen in IFM. Nach Transfektion der BeWo Zellen mit der cDNA für einen HA-markierten humanen MT1 Rezeptor, wurden mehrere Klone mit starker Erhöhung der MT1 mRNA selektiert. Während die Größe (40 kDa) und Menge an Protein, welches von sc-13179 detektiert wurde, sich nicht signifikant gegenüber den parentalen BeWo Zellen veränderte, konnte mithilfe eines anti-HA-Antikörpers der Nachweis eines ~70 kDa Protein in den transfektierten Zellklonen, nicht aber in der parentalen Zelllinie erbracht werden. Diskussion Das deglykosilierte MT1 Kernprotein hat eine molekulare Masse von circa 40 kDa, wobei aber Glykosylierung zu einem höheren Molekulargewicht führt. Die Detektion eines 40 kDa Protein in BeWo Zelllysaten deutet daher an, dass BeWo Zellen entweder nur die nicht-glykosilierte Form des MT1 Rezeptor expremieren, oder aber, dass sc-13179 den glykosilierten Rezeptor nicht erkennt. Letzteres wäre durch die Nähe von Glykosilierungsstellen und Erkennungssequenz von sc-13179 erklärbar. Schließlich wäre es auch denkbar, dass sc-13179 nicht MT1 erkennt, sondern ein Protein mit Sequenzhomologien. Die Ergebnisse aus den HA-MT1-überexpremierenden BeWo Zellen lassen darauf schließen, dass MT1 ein glykosiliertes Protein mit einem Molekulargewicht von etwa 70 kDa ist. Dies unterstützt die Hypothese, dass sc-13179 entweder den glykosilierten MT1 Rezeptor nicht erkennt oder aber ein unbekanntes Protein mit Sequenzhomologien zu MT1 Schlussfolgerung: Es ist weitere Studien notwendig, um MT1 auf Proteinebene unter Anwendung neuer Antikörper in der Plazenta zu charakteriseren. Dies ist wichtig, da MT1 ein wichtiges Ziel für eine therapeutische Anwendung zur Behandlung von Erkrankungen in der Schwangerschaft, die mit veränderten zirkardianen Rhythmen einhergehen, darstellt.
Abstract
(Englisch)
Background: Melatonin (MT), the “hormone of the darkness”, is secreted during the night by the pineal gland and is rapidly distributed to many body fluids and tissues to exert a plethora of functions. Major functions of MT in mammals are mediated by two G-protein-coupled membrane melatonin receptors, MT1 and MT2, respectively. Via its receptors, MT functions as a chronobiotic, promotes sleep, shows immunomodulatory and oncostatic effects. Best investigated is the function of MT for the synchronization of the reproductive response to appropriate environmental conditions in photoperiodic animals. MT can cross the human placenta thereby mediating important photoperiodic information to the fetus. MT via receptor-mediated actions also plays an important role in the regulation of human placental cell development and endocrine function, but these effects have not been investigated systematically. Aim: To elucidate the function of MT and its receptors in the placenta, three commercially available antibodies against MT1, namely sc-13179, ab-13035 and ab-13036, were tested for their applicability of available anti-MT1 antibody, in western blotting experiments (WBE) and immunofluorescence microscopy (IFM) in BeWo and other cell lines with endogenous expression of MT1. 2/ Stable transfection of BeWo cells with the cDNA encoding for the HA-tagged human MT1 receptor was done to generate an MT1-overexpressing cell line which could be used for futher investigation on the effects of the hormone Results: All antibodies reacted positively with MT1 mRNA expressing human cell lines and tissues in WBE and IFM, but detected proteins of diverse molecular weights. In good agreement with the literature, sc-13179 detected a protein of approximately 40 kDa in parental BeWo cell and placental tissue extracts by WBE, and revealed a predominant intracellular localization of MT1 in BeWo cells by IFM. Upon transfection of BeWo cells with the cDNA for a HA-tagged human MT1 receptor, several clones were selected that exhibited a strong increase in MT1 mRNA. While the size (40 kDa) and the amount of protein detected by sc-13179 were not significantly altered in these clones in comparison to the parental BeWo cell line, an anti-HA-tag antibody detected the presence of a ~70 kDa protein in the transfected clones, but not the parental cell line. Discussion: Although the deglycosylated MT1 core protein has a predicted molecular mass of approximately 40 kDa, because of glycosylation, proteins will migrate with a greater molecular mass. Detection of a 40 kDa protein in BeWo cell lysates therefore suggests that BeWo cells express only a non-glycosylated MT1 receptor. Alternatively, the glycosylated receptor is not detected by sc-13179, explainable by the proximity of the N-glycosylation sites of MT1 and the target sequence of sc-13179. Finally, sc-13179 might not detect MT1 at all, but recognizes a protein sharing sequence homologies with MT1. The results obtained with BeWo cells overexpressing the HA-tagged MT1 indicate that (HA-) MT1 is indeed a glycosylated protein with a molecular weight of about 70 kDa and support the hypothesis that sc-13179 either not recognizes glycosylated MT1 receptor or identifies an unknown protein with sequence homologies to MT1. In summary, sc-13179 appears not suitable to investigate MT1 protein functions in BeWo choriocarcinoma cells. Conclusion: Further studies on the expression of MT1 in the placenta are necessary, but should be done with novel antibodies. These studies are important to evaluate MT1 as a potential target for the treatment of diseases will altered circardian rhythm during pregnancy.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
melatonin receptor MT-1 BeWo choriocarcinoma cell lines SDS-page immunofluorescence microscopy
Schlagwörter
(Deutsch)
Melatoninrezeptor MT-1 BeWo Choriokarzinom Zell-Linien SDS-page Immunfluoreszenz Mikroskopie
Autor*innen
Mehdi Ramezanian
Haupttitel (Englisch)
Expression of melatonin receptor MT-1 in the BeWo choriocarcinoma cell line
Paralleltitel (Deutsch)
Expression vom Melatoninrezeptor MT-1 in BeWo Choriokarzinom Zell-Linien
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
153 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Walter Jäger
Klassifikation
44 Medizin > 44.40 Pharmazie, Pharmazeutika
AC Nummer
AC08023400
Utheses ID
7222
Studienkennzahl
UA | 449 | | |