Detailansicht
Evaluation of fibroblast growth factor receptors as therapeutic targets in melanoma
Thomas Metzner
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Betreuer*in
Wolfgang Mikulits
DOI
10.25365/thesis.8104
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-29103.81696.874364-7
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Melanom ist die tötlichste Hautkrebsart und ist in einem fortgeschrittenen Stadium schwierig zu behandeln. Fibroblasten Wachstumsfaktoren (FGF1-23) und deren Rezeptoren (FGFR1-4) sind beteiligt an Tumorwachstum, Angiogenese und Überleben von malignen Zellen bei verschiedensten Tumorarten. Eine krebs-stimulierende Rolle im speziellen beim Melanom, wurde für die Wachstumsfaktoren FGF-1 (aFGF) und FGF-2 (bFGF), sowie den FGF Rezeptor FGFR-1 nachgewiesen. Außerdem wurde eine Korrelation, zwischen der FGFR-4 Protein Expression und dem Überleben von Melanom-Patienten, beschrieben. Es wird auch angenommen, dass der kürzlich identifizierte Arg/Gly Polymorphismus von FGFR-4, die Progression und Zell Migration von einigen Krebsarten stimuliert.
Ziele: Die Ziele waren (A) eine Evaluierung des Potenzials von FGF-Rezeptoren als therapeutische “Targets” in der Melanombehandlung, und (B) die Untersuchung des FGFR-4 Arg/Gly Polymorphismus und seine möglichen Auswirkungen auf Melanom Zelllinien.
Methoden: Die Methoden umfassten, (I) eine Expressionsanalyse von allen FGF-Rezeptoren, sowie deren verschiedenen Isoformen und allen 22 humanen FGF-Liganden mittels Standard PCR und qRT-PCR, (II) Analyse der zellulären Effekte durch Blockierung des FGFR Signals mittels dominant-negativer Rezeptor Konstrukte, (III) Untersuchung der Effekte von FGFR Blockierung auf das Tumorwachstum In Vivo mittels Xenotransplantationsexperimente in SCID Mäusen, (IV) Analyse der Auswirkungen von niedermolekularen FGFR Inhibitoren, im Vergleich zu FGF-2 Stimulation, auf den FGFR Signalweg, (V) Untersuchung von 41 Melanomproben hinsichtlich FGFR-4 Arg/Gly Expressionsmuster und Vergleich mit der Progressionsstufe des Tumors, (VI) Analyse der Effekte des FGFR-4 Arg Allels auf die Zellmigration und Proliferation.
Resultate: Die Expressionsanalyse zeigte, dass der FGFR-1 und der FGFR-4 in nahezu allen Melanom Zelllinien stark exprimiert werden, im Vergleich zu FGFR-2 und FGFR-3. Nimmt man jedoch primäre Melanozyten als Referenz, so scheint ausschließlich die Expression von FGFR-4 und FGFR-2 hinaufreguliert, während die Expression von FGFR-1 auf einem hohen Niveau bestehen, und FGFR-3 unverändert niedrig, bleibt. Im Allgemeinen, ist die Expression der FGF-Rezeptoren und deren Isoformen sehr heterogen ausgefallen, vergleicht man das Expressionsmuster der Zelllinien untereinander. Verkürzte FGFR Isoformen und Isoformen ohne Transmembrandomäne, wurden nur in rund der Hälfte der untersuchten Zelllinien nachgewiesen.
Betrachtet man die Expression der FGF Liganden, so wurde gezeigt, dass FGF-2 in allen untersuchten Melanomzelllinien sehr stark exprimiert wird, im Gegensatz zu primären Melanozyten. FGF-5 wurde in der Mehrheit der Zelllinien (90%) exprimiert, während die Expression von FGF-18 in ungefähr 40% hinaufreguliert war und das Expressionsniveau von FGF-17 und FGF-8 in allen Zelllinien durchwegs niedrig ausfiel.
Eine Inhibierung der FGF-Rezeptoren durch dominant-negative FGFR Konstrukte zeigte, dass eine Blockierung des FGFR-1 Signalweges ein vielversprechender therapeutischer Ansatz beim Melanom ist. Eine „In Vitro“ Inhibierung wurde mittels, Proliferations-, Klonogenizitäts- und Soft Agar- Experimente, getestet. Resultate wurden anschließend „In Vivo“, durch Xenotransplantation von Melanomzellen in SCID Mäuse, bestätigt. Weiters wurde gezeigt, dass eine Inhibierung des FGFR-1 Signalweges in Melanomzellen Apoptose induziert. Dies konnte einerseits durch Fluoreszenz-Mikroskopie und Propidiumjodid Färbung verfolgt werden und wurde schließlich auch mittels Western-Blot Analyse bestätigt.
Es wurde gezeigt, dass die Zellvermehrung um ca. 20-40% zunahm, wenn Melanomzellen mit FGF-2 stimuliert wurden. Die Intensität stimulatorischer Effekte war abhängig vom endogenen Expressionsniveau. Zelllinien mit niedriger FGF-2 Expression konnten leichter mit zusätzlichem FGF-2 stimuliert werden. Auch die Migrationsfähigkeit der Melanomzelllinien konnte um 20-50% erhöht werden, wenn FGF-2 oder FGF-5 zugegeben wurde. Die Stärke der Stimulation durch FGF-2 oder FGF-5, war auch hier von der Eigenproduktion abhängig.
Weiters wurde demonstriert, dass der MAPK- und Akt- Signalweg durch FGF-2 stimuliert werden kann. Aber auch, dass eine vorhergehende Blockierung der FGF-Rezeptoren, durch „Small Molecule Inhibitors“ (PD166866 und SU5402), diese Stimulation verhindert. Eine Blockierung von Signalwegen durch diese Inhibitoren, ohne vorherige Stimulation durch FGF-2, konnte jedoch nicht gezeigt werden.
Eine homozygote Expression des FGFR-4 Gly388 Allels nahm mit zunehmender Krebsprogression deutlich ab (Primärtumore: 65%; Metastasen: 42% und maligne Effusionen: 20%). Ein Einfluss des FGFR-4 Arg388 Allels auf die Progression im Melanom ist daher naheliegend. Bei der Untersuchung von Zellmigration und Proliferation, mittels stabiler Expression des FGFR-4 Arg388 versus Gly388 Allel in Melanomzelllinien, wurde gezeigt, dass die Zellproliferation zwischen den Allelen unverändert bleibt, die Migration in einer von zwei Arg388 Zelllinien aber 2.5 fach zunimmt.
Schlussfolgerungen: In Vivo, sowie In Vitro, wurde gezeigt, dass die Zellproliferation bzw. das Tumorwachstum um 50% reduziert wird, wenn der FGFR-1 Signalweg durch adenovirale dnFGFR1 Konstrukte inhibiert wird. Als Referenz wurden Zellen, anstatt mit dnFGFR1, mit GFP Konstrukten infiziert. Unsere Untersuchungen legen eine therapeutische Blockierung des FGFR-1 nahe. Weiters kann man daraus schließen, dass das FGFR-4 Arg388 Allel möglicherweise zur Progression von Melanomen beiträgt.
Abstract
(Englisch)
Melanoma is the most deadly cutaneous malignancy and is difficult to treat at the advanced stage. Fibroblast Growth Factors (FGF1-23) and Fibroblast Growth Factor Receptors (FGFR1-4) are critically involved in tumour cell growth, survival and angiogenesis of several tumour types. In melanoma several reports have established an oncogenic role of acidic FGF (FGF-1), basic FGF (FGF-2) and FGFR1. Besides, a correlation between FGFR-4 protein expression and survival of melanoma patients has been described. The recently identified Arg/Gly polymorphism of FGFR-4 is suggested to influence cancer progression and cell migration of various tumour types.
Objectives: The purpose of the study was (A) to evaluate the potential of FGFRs as molecular therapy targets for melanoma and (B) to investigate putative cellular effects of the FGFR-4 Arg/Gly polymorphism in melanoma cell lines.
Methods: The thesis included (I) expression analysis in a panel of melanoma cell lines of all four FGFRs including different isoforms, and all 22 FGFs, by standard PCR and qRT-PCR, (II) analysis of cellular effects of blockade of FGFR signals by dominant-negative receptor constructs, (III) the effect of FGFR blockade on tumour growth in vivo by xenotransplantation experiments in SCID mice, (IV) the effect of small molecule FGFR inhibitors, versus FGF-2 stimulation on downstream signalling, (V) effects of FGF-2 on cell migration and proliferation, (V) investigation of 41 melanoma samples for FGFR-4 Arg/Gly expression and comparison with clinical stage, (VI) effects of the FGFR-4 Arg388 allele on cell migration and proliferation.
Results: Expression analysis revealed, that FGFR-1 and FGFR-4 are highly expressed in nearly all melanoma cell lines, compared to FGFR-2 and FGFR-3. Taking non-transformed melanocytes as reference, the expression of FGFR-4 and FGFR-2 seems to be highly up-regulated in nearly all melanoma cell lines, while expression of FGFR-1 is maintained on a high level and FGFR-3 stays low. In general, expression levels of all FGFRs and isoforms were heterogeneous. Truncated FGFR isoforms, especially those lacking the TM-domain, were not detected in around half of the melanoma cell lines. Considering expression of FGF ligands, FGF-2 was found to be highly up-regulated in all melanoma cell lines investigated while FGF-5 was up-regulated in the vast majority (90%). Expression of FGF18 was found up-regulated in 40% and FGF-17 and FGF-8 stayed low in all cell lines. Similar to FGF-Receptors, ligands were also expressed in a heterogeneous manner.
Inhibition of FGFRs by expression of dominant-negative FGFR constructs revealed, that blockade of the FGFR-1 pathway seems to be an effective therapeutic approach in melanoma cells. In vitro inhibition was tested by proliferation assays, clonogenic assays, and soft agar assays. Results have been confirmed in vivo, by xenotransplantation experiments in SCID mice. It has been shown, by blocking the FGFR-1 pathway, that melanoma cell lines induce apoptosis. This was monitored by fluorescence microscopy and propidium-iodide staining, and finally verified by immune-blotting determining protein levels of cleaved PARP1 and Caspase 3.
Cell proliferation was increased around 20-40% when cells were stimulated with exogenous FGF-2. Intensity of stimulatory effects depended on endogenous FGF-2 expression levels. Thus, cell lines with low FGF-2 expression levels were more easily stimulated. Migration of melanoma cells was also stimulated about 20-50%, either by exogenous FGF-2 or FGF-5. Migration of cells having low endogenous FGF-2 or FGF-5 expression was more easily stimulated.
The MAPK- and Akt- signalling pathways were shown to be stimulated by FGF-2. Prior incubation with FGFR small molecule inhibitors, PD166866 and SU5402, prevented stimulation by FGF-2. However, inhibition of constitutive activation of downstream signals by small-molecule FGFR inhibitors alone, could not be shown in this study.
Homozygous expression of the FGFR-4 Gly388 allele was found to be reduced with increasing cancer stage (primary tumours: 62%; metastases: 43%; malignant effusions: 20%), in melanoma cell lines. Therefore, the FGFR-4 Arg388 allele is suggested to be involved in cancer progression of melanoma. Investigating cell migration and proliferation, using stably expressing FGFR-4 Arg388 versus Gly388 cell lines, revealed no differences considering cell proliferation, but migration was increased 2.5 x in one of two FGFR Arg388 cell lines.
Conclusion: In Vivo as well as in vitro, cell proliferation or tumour growth is reduced to about 50%, when infected with adenoviruses bearing dnFGFR1 constructs, compared to GFP as control. Our investigation suggests that FGFR-1 inhibition might be a promising strategy for melanoma therapy. The FGFR-4 Arg388 allele might contribute to melanoma progression.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
fibroblast growth factors melanoma
Schlagwörter
(Deutsch)
Fibroblasten Wachstumsfaktoren Melanom
Autor*innen
Thomas Metzner
Haupttitel (Englisch)
Evaluation of fibroblast growth factor receptors as therapeutic targets in melanoma
Paralleltitel (Deutsch)
Evaluierung von Fibroblasten Wachstumfaktoren als therapeutische Ziele im Melanom
Publikationsjahr
2010
Umfangsangabe
131 S.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Wolfgang Mikulits
AC Nummer
AC08166915
Utheses ID
7305
Studienkennzahl
UA | 490 | | |