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Synthesis of epitope-tagged venom peptide probes targeting NaV1.7
Julius Valentin Pauly
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Chemie
Betreuer*in
Christian Friedrich Wilhelm Becker
DOI
10.25365/thesis.76864
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-12594.53414.669643-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
NaV1.7, einer von neun Subtypen der spannungsabhängigen Natriumkanäle (NaV), ist ein essentielles Target in der Schmerztherapie. Trotz umfangreicher Forschung ist die Entwicklung von NaV1.7-zielgerichteten Analgetika aufgrund begrenzter präklinischer Erfolge und der Herausforderung, eine hohe Selektivität zu erreichen, schwierig. Eine sensitive und selektive Methode zur Detektion von NaV1.7 spielt daher eine entscheidende Rolle in der Forschung und Entwicklung neuer Schmerzmedikamente. Insbesondere angesichts der anhaltenden Opioid-Krise ist die Entwicklung neuer Medikamente für die Behandlung chronischer Schmerzen von großer Bedeutung. Der Einsatz von Giftpeptiden, die verschiedene NaV-Subtypen potent inhibieren, hat zum Verständnis der strukturellen und funktionellen Eigenschaften dieser Ionenkanäle beigetragen. Im Zuge dieser Arbeit wird vorgeschlagen, dass die selektive Visualisierung von NaV1.7 durch den Einsatz modifizierter Giftpeptide als Sonden anstelle von Primärantikörpern in einem Proximity Ligation Assay (PLA) erreicht werden kann. Das Design der Sonden basierte auf den disulfidreichen Giftpeptiden μ-conotoxin KIIIA und μ-Theraphotoxin-Pn3a[D8N]. Lineare Vorstufen von KIIIA und Pn3a[D8N], modifiziert mit einer Spacer-Sequenz und einer Azid-Gruppe, wurden mittels Festphasenpeptidsynthese (SPPS) hergestellt und anschließend thermodynamisch gefaltet. Alkin-funktionalisierte Epitope-Tags wurden synthetisiert und über bioorthogonale CuAAC-Ligation an die Giftpeptide gekoppelt, wodurch eine Reihe von KIIIA- sowie Pn3a-basierten, Epitop-markierten Sonden erhalten wurde. Diese Sonden wurden anschließend elektrophysiologisch an NaV1.7 getestet. Die mit HA-Tag versehenen KIIIA-Sonden zeigten einen Verlust der NaV1.7 hemmenden Potenz, während die mit FLAG-Tag markierten Pn3a[D8N]-Sonden eine 17.7-fache Verringerung der Potenz aufwiesen. Diese ersten Ergebnisse dienten als Grundlage für das Design weiterer auf Pn3a[D8N] basierender Sonden und Derivate, deren Testung noch aussteht. Das Design und die Synthese der Sonden wurden im Zuge dieser Arbeit kritisch bewertet, und es wird ein Forschungsausblick einschließlich einer alternativen Strategie für die weitere Entwicklung von NaV1.7-Sonden auf der Grundlage von Pn3a vorgestellt.
Abstract
(Englisch)
NaV1.7, one of nine subtypes of voltage-gated sodium channels (NaV), is a critical target in pain management. Despite extensive research, developing NaV1.7-targeting analgesics has proven challenging due to limited preclinical success and the difficulty of achieving selectivity, given the high sequence similarity among different NaV subtypes. Selective detection of NaV1.7 is crucial for advancing research and ultimately developing new pain medications, particularly for addressing chronic pain in light of the ongoing opioid crisis. Venom peptides that potently inhibit NaV subtypes have been invaluable in advancing our structural and functional understanding of these channels. In the scope of this work, it is proposed that the selective visualization of NaV1.7 can be achieved by using modified venom peptides as probes instead of primary antibodies in a Proximity Ligation Assay (PLA). The primary objective was to design and synthesize probes that preserve the high affinity and selectivity of the original venom peptides. The designed probes were derived from the disulfide-rich μ-conotoxin KIIIA and μ-Theraphotoxin-Pn3a[D8N]. Linear precursors of KIIIA and Pn3a[D8N], modified with a spacer sequence and an azide moiety, were assembled using solid-phase peptide synthesis (SPPS) and thermodynamically folded. Alkyne-functionalized epitope tags were synthesized and ligated to the venom peptides via bioorthogonal CuAAC ligation, resulting in a series of KIIIA- and Pn3a-based epitope-tagged probes. These probes were then electrophysiologically tested on NaV1.7. The HA-tagged KIIIA probes exhibited a loss of inhibitory potency, while the FLAG-tagged Pn3a[D8N] demonstrated an 17.7-fold decrease in potency. These initial results guided the design of additional probes and Pn3a derivatives, which are yet to be tested. The probe designs and syntheses were critically evaluated, and next steps, and a research outlook for further NaV1.7 probe development based on Pn3a, is presented.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Gifte Peptide Spannungsgesteuerte Natriumkanäle NaV1.7 PLA Conotoxine Theraphotoxine Festphasenpeptidsynthese Elektrophysiologie KIIIA Pn3a Proximity Ligation Assay
Schlagwörter
(Englisch)
Venoms Peptides Voltage gated sodium channels NaV1.7 PLA Conotoxins Theraphotoxins Solid Phase Peptide Synthesis Electrophysiology KIIIA Pn3a Proximity Ligation Assay
Autor*innen
Julius Valentin Pauly
Haupttitel (Englisch)
Synthesis of epitope-tagged venom peptide probes targeting NaV1.7
Paralleltitel (Deutsch)
Synthese von Epitop-markierten Giftpeptid-Sonden gegen NaV1.7
Publikationsjahr
2024
Umfangsangabe
xi, 146 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Christian Friedrich Wilhelm Becker
Klassifikation
35 Chemie > 35.79 Biochemie. Sonstiges
AC Nummer
AC17348422
Utheses ID
73084
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |