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Investigating EGFR dimerization dynamics
analyzing cancer-associated mutants using DARPins and TOCCSL
Stefan Jandrisits
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molekulare Biologie
Betreuer*in
Maria Sibilia
DOI
10.25365/thesis.76915
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-21180.52333.527828-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Krebs ist nach wie vor eine erhebliche globale gesundheitliche Belastung mit Millionen von Todesfällen pro Jahr. Jegliche Bemühungen seinen Auswirkungen entgegenzuwirken sind immens wichtig. Der Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), auch HER1/ErbB1, ist eine äußerst wichtige Zelloberflächenrezeptor-Tyrosinkinase, die für verschiedene zelluläre Prozesse, einschließlich Differenzierung, Stoffwechsel und Wachstum, entscheidend ist. Eine Fehlregulation von EGFR und seinen Familienmitgliedern gilt nachweislich als wesentlicher Faktor für die Entstehung verschiedener Krebsarten. Wir haben uns daher für diese Arbeit vorgenommen, die Mechanismen und die Dimerisierungsdynamik des EGFR aufzuklären, da immer noch Fragen zu seinen oligomeren Zuständen bestehen, insbesondere im nativen Zustand. Der Fokus liegt auf den Vergleich von EGFR-Varianten, die Mutationen tragen die bei Krebserkrankungen beim Menschen vorkommen, mit dem Wildtyp-Rezeptor. Besonderes Augenmerk galt den Mutanten L858R und L858R+T790M die häufig bei Patienten mit nicht-kleinzelligem Lungenkrebs beobachtet werden und dadurch interessant sind.
Wir haben erfolgreich Plasmide mit einem Mutageneseschritt geklont und verändert, wobei durch einen Basenpaarwechsel in einem L858R-Plasmid ein L858R+T790M-Konstrukt etabliert wurde. Diese menschlichen EGFR-Varianten wurden anschließend über ein lentivirales Transduktionssystem in embryonale Mausfibroblasten (MEF) transfiziert, die von EGFR-Knockout-Mäusen stammten. Zur Verifizierung haben wir die MEF-Zelllinien mit Immunfluoreszenztests sowie Western Blot und Durchflusszytometrie geprüft. Um die Oligomerisierung von EGFR effektiv zu visualisieren, haben wir ein präzise ausgewogenes Fluorophorsystem etabliert. Durch den Einsatz von DARPins (Designed Ankyrin Repeat Proteins), die mit einem Maleimidfarbstoff markiert sind, konnten wir die EGFR-Dynamik auf Zelloberflächen mittels Einzelmolekülmikroskopie erfolgreich beobachten und zusätzlich ihr Potenzial als Markierungsprotein testen. Mit der Anwendung von TOCCSL (entwickelt an der TU Wien) haben wir Daten von A431-Zellen erhalten, die den Monomer- und Dimerzustand von EGFR auf der Zelloberfläche aufzeigen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die erfassten Daten weitere Studien anregen, die durch die grundlegende Funktion von DARPins und TOCCSL als gekoppelte Werkzeuge gestützt werden.
Abstract
(Englisch)
Cancer persists as a significant global burden with millions of deaths every year and the effort to counteract its actions cannot be ever enough. The Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR), also HER1/ErbB1, is a highly important cell surface receptor-tyrosine kinase crucial for various cellular processes, including differentiation, metabolism, and growth. Dysregulation of EGFR, along with its family members, has been well-established as a significant contributor to the development of various types of cancer. We therefore set out to elucidate the mechanisms and dimerization dynamics of the EGFR as questions still persist regarding its oligomeric states especially in a native state. Therefore, we focused on comparing EGFR variants bearing mutations found in human cancers with the wild-type receptor. Notably, the L858R and L858R+T790M mutants are frequently observed in non-small-cell lung cancer patients, making them particularly interesting. We successfully cloned and altered plasmids with a mutagenesis step, wherein through a base pair switch in a L858R plasmid a L858R+T790M construct was established. These human EGFR variants were subsequently transfected into mouse embryonic fibroblasts (MEF) derived from EGFR knockout mice through a lentiviral delivery system. We obtained data, for verification, from MEF cell lines with immunofluorescence assays as well as western blot and Flow Cytometry. To visualize the oligomerization of EGFR effectively, we established a precisely balanced fluorophore system. By employing DARPins (Designed Ankyrin Repeat Proteins) labeled with a maleimide dye we successfully observed EGFR dynamics on a cell surface via single molecule microscopy and additionally tested their potential as labeling protein. With the application of TOCCSL (developed at TU Wien) we obtained data from A431 cells revealing monomeric and dimeric states of EGFR on the cell surface. In summary, the acquired data encourages further studies backed by proof of principle in using DARPins and TOCCSL coupled as tools.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Rezeptor Tyrosinkinasen Krebs Lungenkrebs Dimerisierung EGF-Rezeptor TIRF Mikroskopie
Schlagwörter
(Englisch)
EGFR EGF Receptor Cancer Lung Cancer Single molecule microscopy TIRF Dimerization
Autor*innen
Stefan Jandrisits
Haupttitel (Englisch)
Investigating EGFR dimerization dynamics
Hauptuntertitel (Englisch)
analyzing cancer-associated mutants using DARPins and TOCCSL
Publikationsjahr
2024
Umfangsangabe
75 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Maria Sibilia
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC17356074
Utheses ID
73195
Studienkennzahl
UA | 066 | 834 | |