Detailansicht
Reconstitution of ISG15 and its conjugation machinery to study the effects of ISGylation on the proteome during viral infection
Miriam Theresa Philipp
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Mikrobiologie und Umweltsystemwissenschaft
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molecular Microbiology, Microbial Ecology and Immunobiology
Betreuer*in
Marco Yannic Hein
DOI
10.25365/thesis.76961
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-28875.58659.104578-4
Link zu u:search
(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die angeborene Immunantwort ist die erste Verteidigung einer Zelle im Kampf gegen Pathogene. Sobald der Krankheitserreger erkannt wird, signalisiert die Zelle mit Hilfe von Interferonen den benachbarten Zellen, dass sie bestimmte Gene transkribieren sollen. Eines der Gene, welches durch die Interferon-Reaktion Typ 1 am stärksten und schnellsten induziert wird, ist das Interferon-stimulierte Gen 15 (ISG15). Ähnlich wie bei der Ubiquitinierung erfordert die Konjugation von ISG15 an seine Zielproteine eine Kaskade von drei Enzymen (E1, E2, und E3). Da ISG15 durch den Interferon-Signalweg produziert wird, wird vermutet, dass sowohl ISGylierung als auch ISG15 zur Abwehr einer Virusinfektion beitragen. Um die Auswirkungen der ISGylierung während einer Virusinfektion vollständig zu charakterisieren, ist es erforderlich, das gesamte Proteom zu betrachten. Des Weiteren beeinflusst ISGylierung zahlreiche Wirtsproteine, insbesondere jene, die als Reaktion auf die Interferon-Signalgebung produziert werden, dies stellt eine weitere Herausforderung dar. Daher war es unser Ziel, ein System zu entwickeln, bei dem die ISGylierung von der globalen Interferon-Reaktion getrennt werden kann. Zuerst wurden Plasmide entwickelt, die die Sequenzen aller Komponenten wichtig für ISGylierung enthielten. Die Gene für ISG15 und die Enzyme E1, E2 und E3 wurden in lentivirale Vektoren geklont, die dann zur Erzeugung von Zelllinien verwendet wurden, diese Gene über das TetOn-System exprimieren. Wir konnten zeigen, dass die Interferon-Reaktion mit dem JAK-Inhibitor Ruxolitinib wirksam ausgeschaltet werden konnte. Diese Zelllinien können für die Analyse des gesamten Proteoms einer Zelle verwendet werden, um mehr Einblick in die Auswirkungen der ISGylierung auf das menschliche Proteom zu gewinnen, ohne von der Interferon-Reaktion beeinflusst zu werden.
Abstract
(Englisch)
The innate immune response is the first line of defense against invading pathogens. Once the pathogen is sensed, infected cells secrete cytokines such as interferons, which trigger a transcriptional response in cells in the surroundings. One of the genes that the type 1 Interferon response induces most strongly and quickly is interferon stimulated gene 15 (ISG15). The protein consists of two ubiquitin-like domains connected by a hinge region and was initially found due to its cross-reactivity with anti-ubiquitin antibodies. While ISG15 only shares about 30% sequence homology with ubiquitin, the C-terminal amino acid motif, "LRLRGG" is conserved, allowing the protein to establish covalent isopeptide bonds with its target substrates, in a process termed ISGylation. Similar to ubiquitination, conjugation of ISG15 to its target proteins requires a cascade of three enzymes, in humans, these are: UBA7, an ATP-dependent E1 activating enzyme, UBE2L6 as the E2 conjugating enzyme, and one of three E3 ligases, HERC5, TRIM25, and ARIH1. Given that the Interferon pathway induces ISG15, it has been suggested that both ISGylation and ISG15 contribute to the host's defense against viral infection. To fully characterize the impact of ISGylation during viral infection, a proteome-wide approach is necessary, as previous studies mostly examined the effects of ISGylation on individual host and viral proteins. Studying ISGylation specifically presents additional challenges since it impacts a wide range of host proteins, particularly those other proteins that are produced in response to Interferon signaling. Thus, it was our objective to engineer a system where ISGylation can be disentangled from the global Interferon response. First, plasmids containing the sequences of all components of the ISGylation machinery were designed. The genes for ISG15 and the E1, E2, E3 enzymes were cloned into lentiviral vectors, which were then used to generate cell lines inducibly expressing the ISGylation machinery via the TetOn system. ISG15 was cloned in variants that are either tagged with V5 or untagged, and conjugation competent or conjugation deficient, because of mutations in the “LRLRGG” motif. To model endogenous ISGylation levels we tested multiple time points of induction for the TetOn system. Furthermore, we showed that the Interferon response could be effectively shut down with the JAK inhibitor Ruxolitinib, with the idea of suppressing the global response generally while inducing the ISGylation machinery specifically. These engineered cell lines can be used for whole proteome analysis to gain more insight into the specific effects of ISGylation on the human proteome without the context of a general interferon response. Moreover, our ISG15 constructs are fused to a V5 tag to enable pulldown assays enriching for ISGylated proteins. The cells will also be used to identify viral ISGylation substrates.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
ISGylierung Interferon ISG Posttranslationale Modifikation
Autor*innen
Miriam Theresa Philipp
Haupttitel (Englisch)
Reconstitution of ISG15 and its conjugation machinery to study the effects of ISGylation on the proteome during viral infection
Publikationsjahr
2024
Umfangsangabe
51 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Marco Yannic Hein
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC17360602
Utheses ID
73391
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |