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Expression of recombinant Flavivirus E proteins
Beate Geller
Art der Arbeit
Diplomarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Betreuer*in
Franz Heinz
DOI
10.25365/thesis.8190
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-30401.06003.413462-7
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Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Frühsommer-Meningoenzephalitis Virus (FSME-Virus) ist ein humanpathogenes
Virus aus der Familie Flaviviridae. Flaviviren sind einzelstrang-
RNA-Viren, die von einer Hüllmembran umgeben sind. Das Glycoprotein E an
der Virusoberfläche ist essentiell für das Eindringen des Virus in die Wirtszelle.
Nachdem das Virus über Endocytose von der Zelle aufgenommen wurde,
bewirkt die Ansäuerung des Endosominneren die Fusion der viralen mit der
endosomalen Membran. Dieser Fusion liegt eine Konformationsänderung des E
Proteins zu Grunde, welches im nativen Zustand ein Dimer darstellt und sich bei
saurem pH irreversibel in ein Trimer umlagert. Obwohl die atomaren Strukturen
des C-terminal-verkürzten E Proteins bekannt sind, ist der Fusionsmechanismus
im Detail noch nicht aufgeklärt. Biochemische Daten haben gezeigt, dass die
„Stamm-Anker-Region“, welche in den gelösten Kristallstrukturen fehlt,
vermutlich eine wichtige Rolle im Fusionsprozess spielt. Um die Funktion der
„Stamm-Region“, welche das sE mit dem Transmembrananker verbindet
genauer zu untersuchen wurden im Rahmen dieser Diplomarbeit hoch
aufgereinigte FSME-Virus E Proteine, welche die „Stamm-Region“ beinhalten,
rekombinant hergestellt. Die produzierten Proteine sollen später in ihrer
trimeren, postfusionären Form kristallisiert werden, um die Rolle des
„Stammes“ während des Fusionsprozess aufklären zu können. Für diese Zwecke
wurde das Protein TBEsE H1/H2_dstrep, das den gesamten Stamm und TBEsE
H1_dstrep, das nur Teile des Stammes beinhaltet, in stabil transfektierten
Drosophila Zellen exprimiert. TBEsE H1_dstrep wurde in seiner dimeren Form
exprimiert und wies eine Reinheit von 70-95% nach der Aufreinigung auf. Das
aufgereinigte rekombinante Protein wurde mit saurem pH behandelt, was zur
Umlagerung in den trimeren Zustand führte. Dieses Ergebnis ermöglicht eine
weitere Verwendung des Proteins für Kristallisierungsstudien.
Abstract
(Englisch)
Tick-borne encephalitis virus (TBEV) is an enveloped virus and an important
human pathogen, which belongs to the family Flaviviridae. Flaviviruses, like
other enveloped viruses, enter cells via a membrane fusion reaction driven by
conformational transitions in the major envelope glycoprotein E. This fusion
mechanism is triggered by the acidic pH in endosomes after virus uptake by
receptor-mediated endocytosis. Although the dimeric pre- and trimeric
postfusion forms of a C-terminally truncated form of E (sE) have been
determined by atomic resolution, some steps of the fusion mechanism are still
unexplained. The crystallized, truncated E proteins lack the so-called stemanchor
region, which has been hypothesized to play an important role in the
fusion process by bringing the host and viral membrane into close proximity
through a so-called zippering action. This work focused on the preparation of
highly purified TBEV E proteins that include the stem region for the structural
determination of the trimeric post-fusion form. Knowledge of this structure
should elucidate the role of the stem during membrane fusion. This work reports
the expression of the proteins: TBEsE H1/H2_dstrep – containing the whole
stem region - and TBEsE H1_dstrep – containing only parts of the stem, in
stable transfected Drosophila cell lines. TBEsE H1_dstrep was purified using
Strep tag technology. The oligomeric form, TBEsE H1_dstrep, was dimeric and
we were able to obtain it at a high purity of 70-95%. The exposure to low pH
allowed the transition into the trimeric post-fusion form which will be used in
subsequent crystallization studies.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Englisch)
tick-borne encephalitis virus (TBEV) Flavivirus Glykoprotein E sE Fusionmechanism Dimer-Trimer-convertion Function stem-anchor-region Expression Drosophila cells recombinant proteins
Schlagwörter
(Deutsch)
Frühsommer-Meningoenzephalitis Virus (FSME-Virus) Flaviviren Glycoprotein E sE Fusionsmechanismus Dimer-Trimer-Umlagerung Funktion Stamm-Anker-Region Expression Drosophila Zellen rekombinante Proteine
Autor*innen
Beate Geller
Haupttitel (Englisch)
Expression of recombinant Flavivirus E proteins
Paralleltitel (Deutsch)
Expression rekombinanter Flavivirus E Proteine
Publikationsjahr
2009
Umfangsangabe
57 S. : Ill., graph. Darst.
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Franz Heinz
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
42 Biologie > 42.32 Virologie
AC Nummer
AC08156921
Utheses ID
7377
Studienkennzahl
UA | 490 | | |