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Improving in vitro Tau ubiquitination to dissect its interaction with the autophagy machinery
Lara Klune
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molecular Biology
Betreuer*in
Sascha Martens
DOI
10.25365/thesis.77358
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-11233.98019.267152-2
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Ubiquitinierung von Proteinen ist ein Prozess, der die kovalente Bindung einer oder mehrerer Ubiquitin-Einheiten an spezifische Proteine umfasst. Dieser Vorgang ist ein wichtiger Schritt in vielen Signalwegen der Zelle und essentiell dafür, dass Proteine für den Abbau durch das Proteasom oder durch Autophagie markiert werden. Dies sind die beiden wichtigsten Degradierungsmechanismen der Zelle. Eine Dysregulation innerhalb dieser Signalwege und damit beim Proteinabbau kann mit diversen Krankheiten in Verbindung gebracht werden. Unter anderem mit neurodegenerative Leiden wie der Alzheimer-Krankheit, bei der es zu einer Akkumulation von abnormalen Formen des Proteins Tau kommt. In dieser Arbeit wurden E1 (UBA1), E2 (UbcH5B oder Uev1:Ubc13) und E3 (CHIP +HSPA1A) Enzyme kombiniert, um die Ubiquitinierung von Tau in vitro zu rekonstituieren. Verschiedenste Aspekte der Protein-Ubiquitinierung wurden analysiert und optimiert, die vor allem die Spezifität der Ubiquitinketten (Ubiquitinketten-Länge, -Verknüpfung und Substratauswahl) betrafen. Das EEVD Motiv von HSPA1A ist essentiell für die Verknüpfung mit der E3 Ligase CHIP. In den durchgeführten Experimenten wurde beobachtet, dass dieses Motiv, und die dadurch vermittelte Verbindung zu CHIP, eine Rolle in der spezifischen Ubiquitinierung von Tau spielen. Zusätzlich wurden K0, K48 und K63 Ubiquitin-Varianten angewandt, um spezifische Ubiquitin-Modifizierungen auf Tau herzustellen. NBR1 und p62, beides Cargo Rezeptoren der Autophagie, wurden auf ihre Affinität zu diesen spezifischen Ubiquitinketten auf Tau untersucht. Unter den angewandten experimentellen Bedingungen wurde eine überraschende Präferenz für Verknüpfungen über K48 im Vergleich zu K63 für beide Rezeptoren festgestellt. Darüber hinaus wurden verschiedene Aufreinigungsverfahren für ubiquitiniertes Tau getestet und beschrieben.
Abstract
(Englisch)
The ubiquitination of proteins, a highly variable and specific post-translational modification, is a crucial component of cell signaling. It plays a pivotal role in determining the fate of proteins, either by targeting them to the ubiquitin-proteasome system or autophagy, the two major degradation systems of the cell. Dysregulation of these pathways is associated with a range of diseases, including neurodegenerative conditions like Alzheimer’s disease, characterized by the accumulation of abnormal Tau protein species. In this thesis, a ubiquitination machinery composed of the E1 UBA1, an E2 (UBCH5B or UEV1:UBC13) and the E3 CHIP (+HSPA1A) was used to reconstitute the ubiquitination of the physiological substrate Tau in vitro. Different aspects of this process were investigated and improved, mainly concerning the specificity (in terms of length, linkage or targeted lysine residues) of the attached ubiquitin chains and their interaction with the autophagy machinery. The EEVD motif of the molecular chaperone HSPA1A is essential for its association with the E3 ligase CHIP. A role for this motif was observed in targeting specific lysine residues of Tau for ubiquitination. Additionally, K0, K48 and K63 ubiquitin variants were employed to attempt length and linkage control of ubiquitin chains on Tau. Tau modified with specific K48- and K63-linked ubiquitin chains was tested for its affinity to autophagic cargo receptors. The p62 and NBR1 receptors displayed a surprising preference for K48-linked chains on Tau under the applied experimental settings. Lastly, this work describes several attempts at purifying ubiquitinated Tau.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Ubiquitinierung Autophagie Alzheimer
Schlagwörter
(Englisch)
Tau HSP70 HSPA1A Ubiquitin p62 NBR1 Autophagy Aggrephagy Alzheimer's disease Ubiquitination CHIP EEVD TUBEs TPR Domain cargo receptor K0 Ubiquitin K48 Ubiquitin K63 Ubiquitin UBCH5B UEV1:UBC13
Autor*innen
Lara Klune
Haupttitel (Englisch)
Improving in vitro Tau ubiquitination to dissect its interaction with the autophagy machinery
Publikationsjahr
2024
Umfangsangabe
69 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Sascha Martens
AC Nummer
AC17396201
Utheses ID
73774
Studienkennzahl
UA | 066 | 865 | |