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Enzyme mechanisms beyond oxygen rebound
synthesis of isotopically labelled DfmD, FfnD and TmpA substrates and biochemical study
Sebastian-Felix Fritz
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Chemie
Betreuer*in
Katharina Pallitsch
DOI
10.25365/thesis.77359
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-22366.83595.736522-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die vorliegende Arbeit konzentriert sich auf die Synthese und die mechanistische Untersuchung Deuterium-markierter Substrate der Enzyme DfmD, FfnD und TmpA (non-heme iron(II) and 2-oxoglutarate-dependent Oxygenasen), die außergewöhnliche Transformationen in Phosphonat-Biosynthesewegen katalysieren. Die vorliegende Arbeit soll zur Erforschung der Mechanismen dieser Enzyme beitragen. Insbesondere deren Fähigkeit, einen typischen "Oxygen-Rebound" zu unterdrücken und stattdessen Epoxidierungen, Desaturierungen und Demethylierungen zu katalysieren, soll näher untersucht werden. Die Synthese der isotopenmarkierten Zielsubstanzen war vor allem unter Berücksichtigung (atom-)ökonomischer Aspekte von Interesse für diese Arbeit. Enzymassays unter Verwendung der synthetisierten Deuterium-markierten Substrate wurden durchgeführt, um die resultierenden kinetischen Isotopeneffekte (KIE) zu untersuchen. Stopped-Flow-Methoden, Massenspektrometrie (MS) und NMR-Analysen waren zentrale Techniken zur Messung dieser Effekte und ermöglichten Einblicke in die Enzymeffizienz. Die Ergebnisse legen nahe, dass der Isotopenaustausch spezifische Bindungsbrüche, die an kritischen Reaktionsschritte beteiligt sind, sowie die Enzym-Substrat Bindung beeinflussen. Die vorliegende Arbeit trägt daher sowohl zu einem besseren Verständnis der Phosphonatbiosynthese, als auch zur Entwicklung neuer Strategien zur Deuterium-Markierung bei.
Abstract
(Englisch)
This thesis focuses on the synthesis of deuterated substrate analogues for the enzymes DfmD, FfnD, and TmpA, and on mechanistic studies on these non-heme iron(II) and 2-oxoglutarate-dependent oxygenases using the synthesised substrates. All of these enzymes catalyse unusual transformations in phosphonate biosynthetic pathways. The study aims at clarifying their mechanisms, particularly their unique ability to diverge from typical oxygen rebound reactions, and to catalyse transformations such as epoxidations, desaturations, and demethylations instead. This work addresses the challenges of achieving high enantioisotopic purity, while minimising costs through efficient incorporation of deuterium labels using atom-economic, synthetic pathways. To achieve these aims, multiple synthetic strategies either using all-protio substrates in combination with asymmetric transfer deuteration or deuterated aldehydes in combination with stereoselective, catalytic reductions using varied borane reagents were tried. Additionally, various analytical methods were employed to determine the enantioisotopomeric excess of the obtained compounds, including the use of chiral solvating agents and derivatization strategies in combination with nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy. Enzyme assays utilizing the synthesised deuterated compounds were conducted to explore kinetic isotope effects (KIE) and to observe isotope-sensitive steps in the enzyme catalytic cycles. Stopped-flow-methods (with UV/Vis-spectroscopy detection), mass spectrometry (MS), and nuclear magnetic resonance (NMR) assays were key techniques in measuring these effects, revealing significant details of the coupling efficiency of the target enzymes and of the intermediate formation. Results, which only became possible using the target compounds, indicate that deuterium incorporation affects bond dissociation at critical points, slowing reaction rates and potentially impacting enzyme-substrate coupling efficiency. Thus, this study both provides new insights on potential strategies for deuterium incorporation in a site- and stereoselective way and contributes to a deeper understanding of phosphonate biosynthetic enzymes.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Synthesechemie Chemie Bioorganische Chemie Organische Chemie Biochemie Phosphor NMR Enzyme Deuterium Isotop Phosphor in der Natur FfnD TmpA DfmD
Schlagwörter
(Englisch)
Synthesis Organic Synthesis Bioorganic Chemistry Organic Chemistry Biochemistry Phosphorus NMR Enzyme Deuterium Isotope Phosphorus in Nature FfnD TmpA DfmD
Autor*innen
Sebastian-Felix Fritz 
Haupttitel (Englisch)
Enzyme mechanisms beyond oxygen rebound
Hauptuntertitel (Englisch)
synthesis of isotopically labelled DfmD, FfnD and TmpA substrates and biochemical study
Paralleltitel (Deutsch)
Enzymmechanismen jenseits des Oxygen Rebound
Paralleluntertitel (Deutsch)
Synthese isotopenmarkierter DfmD-, FfnD- und TmpA-Substrate und biochemische Untersuchungen
Publikationsjahr
2024
Umfangsangabe
89, II Seiten
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Katharina Pallitsch
Klassifikationen
35 Chemie > 35.50 Organische Chemie. Allgemeines ,
35 Chemie > 35.74 Enzyme. Hormone. Vitamine
AC Nummer
AC17396218
Utheses ID
73896
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |