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Higher-order functional genomics with Cas12a-based platforms
Leon Anthony Schmidt
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molecular Microbiology, Microbial Ecology and Immunobiology
Betreuer*in
Marco Yannic Hein
DOI
10.25365/thesis.77337
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-27397.84595.264726-3
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
CRISPR-Cas-Proteine haben sich zu äußerst effizienten und vielseitigen Instrumenten der funktionellen Genomik entwickelt. Viele fortgeschrittene Ansätze erfordern die parallele Bearbeitung mehrerer Loci in derselben Zelle. Dies stellt eine Herausforderung für Lentivirus-basierte CRISPR-Cas9-Screening-Implementierungen dar, da das lentivirale Template-Switching chimäre Proviren erzeugt, die die Skalierbarkeit dieser Methode für Multiplexing einschränken. Eine mögliche Lösung besteht darin, die von Natur aus multiplexe Eigenschaft endogener CRISPR-Loci zu nutzen, bei denen homologe Regionen minimiert sind. Zu diesem Zweck testeten wir multiAsCas12a, eine Nickase-Version eines CRISPR-Effektors der Klasse II, Typ V. multiAsCas12a ist in der Lage, seine eigene Anordnung von crRNAs zu verarbeiten, die von einem einzigen RNA-Polymerase-III-Promotor exprimiert werden, und enthält Mutationen in Schlüsselbereichen, die das Cas-Protein in eine DNase-langsame Version verwandeln, um DNA-Schäden zu minimieren. Wir fanden heraus, dass die Plattform zwar nur minimale Verbesserungen benötigte, die im Experiment verwendete Zelllinie jedoch die Wirksamkeit der Störung drastisch beeinflusste. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Menge des Cas12-Proteins die Effizienz einschränkt, insbesondere in Kombination mit einer Anordnung von mehreren crRNAs. Diese Arbeit hebt wichtige Nachteile der Cas12a-Plattform für Gen-Perturbation hervor, die, wenn diese Probleme behoben werden, das Potenzial hat, ein hocheffizienter und unkomplizierter Ansatz für multiplexes und kombinatorisches Gen-Targeting zu werden.
Abstract
(Englisch)
CRISPR-Cas proteins have become extremely efficient and versatile tools in functional genomics. Many advanced approaches require the targeting of multiple loci in parallel in the same cell. This poses challenges for lentivirus-based CRISPR-Cas9 screening implementations because lentiviral template switching produces chimeric proviruses, which limit the scalability of this method for higher-order multiplexing. A possible solution is to capitalize on the inherently multiplexed nature of endogenous CRISPR loci, where homologous regions are minimal in length. For this purpose, we tested the utility of multiAsCas12a, a nickase version of a Class II, Type V CRISPR effector. multiAsCas12a is capable of processing its own array of crRNAs expressed from a single RNA Polymerase III promoter while containing mutations in key residues that turn the Cas protein into a DNase-slow version to minimize DNA damage. We found that while the platform needed minimal improvements, the cell line used in the experiment drastically influenced the efficacy of the perturbation at a given locus. Furthermore, we found that the levels of the Cas12 protein can be the limiting factor, especially when combined with an array of multiple crRNAs. This thesis highlights important caveats of the Cas12a gene perturbation platform which, if these issues are addressed, holds the potential to become a highly efficient and straightforward approach for multiplexed and combinatorial gene targeting.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Funktionelle Genomik CRISPR Cas12a
Schlagwörter
(Englisch)
Functional Genomics CRISPR Cas12a Higher-order Combinatorics Multiplexing
Autor*innen
Leon Anthony Schmidt 
Haupttitel (Englisch)
Higher-order functional genomics with Cas12a-based platforms
Publikationsjahr
2024
Umfangsangabe
44 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Marco Yannic Hein
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC17394859
Utheses ID
73960
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |