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Immune responses to cow's milk allergens

molecular allergen characterization and epitope mapping

Heidrun Hochwallner

Art der Arbeit

Dissertation

Universität

Universität Wien

Fakultät

Fakultät für Lebenswissenschaften

Betreuer*in

Rudolf Valenta

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DOI

10.25365/thesis.8226

URN

urn:nbn:at:at-ubw:1-30009.08263.822270-2

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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)

Abstracts

Abstract

(Deutsch)

Kuhmilchallergie ist die am häufigsten auftretende Lebensmittelallergie innerhalb der ersten Lebensjahre und betrifft ungefähr 2-3% aller Säuglinge und Kleinkinder in Industrieländern. Die meisten Patienten mit Kuhmilchallergie leiden unter Symptomen, die mehr als ein Organ betreffen, wie zum Beispiel kutane, gastrointestinale und respiratorische Symptome und im schlimmsten Fall lebensbedrohliche anaphylaktische Reaktionen. Ungefähr 60% aller allergischen Reaktionen auf Kuhmilch sind IgE-vermittelt und ungefähr 40% sind nicht-IgE-vermittelt. Die Mechanismen bei nicht-IgE-vermittelten Unverträglichkeiten sind nicht genau bekannt und können andere Immunglobuline und/oder zell-vermittelte Wirkungsweisen umfassen. Der Schwerpunkt dieser Dissertation liegt in der Isolierung von cDNAs, die für Hauptallergene in der Kuhmilch kodieren, sowie in der Expression dieser Allergene in rekombinanter Form in Escherichia coli. Dabei wurden zwei Milchproteine, Alpha-Laktalbumin aus der Molkefraktion und AlphaS1-Kasein aus der Kaseinfraktion im Detail charakterisiert. Beide Allergene wurden hinsichtlich ihrer biochemischen Eigenschaften mittels SDS-PAGE, Zirkulardichroismus und Massenspektrometrie analysiert. Ihre IgE Reaktivität wurde durch Immunblotting und ELISA gezeigt und ihre biologische Aktivität durch Degranulation von basophilen Granulozyten bestätigt. Durch die Anwendung von synthetischen Peptiden wurden lineare Epitope auf beiden Allergenen gefunden und es konnte das Vorhandensein von Konformationsepitopen nachgewiesen werden. Diese beiden rekombinanten Allergene können nun für eine Komponenten-spezifische Diagnostik bei Patienten mit Kuhmilchallergie verwendet werden. Weiters wurden die IgE-reaktiven und biologisch aktiven Allergene zur Entwicklung eines neuen Diagnosesystems verwendet, das aus einem Allergen-Mikroarray und einem Test zur Bestimmung von Mediatorenfreisetzung besteht. Die Mikroarray-Technologie erlaubt die Austestung von vielen verschiedenen Allergenen auf einmal, dies stellt vor allem bei dem Vorhandensein von kleinen Serummengen bei Säuglingen und Kleinkindern einen großen Vorteil dar. Die Kombination mit einem biologischen Test ermöglicht es, Patienten mit Risiko für starke systemische Reaktionen zu identifizieren. Dies ist sinnvoll bei starken Kuhmilchallergikern, die beim Durchführen von in vivo Tests wie Provokationstests an starken Reaktionen leiden könnten. Ein anderer Scherpunkt dieser Dissertation liegt in der Untersuchung von immunologischen Mechanismen, die durch eventuell nicht-IgE-vermittelte Reaktionen nach Konsum von Kuhmilch auftreten können. Die Bestimmung von IgG1-4 Subklassen und IgA Antikörpern gegen gereinigte rekombinante Proteine zeigte, dass Patienten mit nicht-IgE-vermittelter Kuhmilchunverträglichkeit basierend auf der humoralen Immunantwort auf Kuhmilchantigene nicht von Personen ohne Kuhmilchintoleranz unterschieden werden können. Wir sind deshalb zu dem Schluss gekommen, dass andere Antikörper als IgE geringen Einfluss auf Kuhmilchunverträglichkeiten haben. Zusammenfassend war es möglich, innerhalb dieser Dissertation Hilfsmittel zu entwickeln, die bei der Komponenten-spezifischen Diagnostik von IgE-vermittelter und nicht-IgE-vermittelter Kuhmilchallergie eingesetzt werden können. Dadurch erhält man wertvolle Informationen, die in Zukunft bei der Entwicklung von Strategien zur Behandlung von Kuhmilchallergie verwendet werden können.

Abstract

(Englisch)

Cow’s milk allergy is the most prevalent food allergy in the first years of life, affecting about 2 to 3% of infants and young children in developed countries. Most cow’s milk allergic patients suffer from symptoms in more than one organ system showing cutaneous, gastrointestinal, respiratory symptoms, and in the worst case anaphylactic reactions. Around 60% of all allergic reactions to cow’s milk are IgE-mediated and around 40% are non-IgE-mediated. The mechanisms of the later might involve other immunoglobulins, immune complexes, and/ or cell-mediated mechanisms. The main aim of this thesis was the isolation of cDNAs coding for major cow’s milk allergens and the expression of these allergens in a recombinant form in Escherichia coli. The focus was on two milk proteins, alpha-lactalbumin, deriving from the whey fraction, and alphaS1-casein, deriving from the casein fraction. Both allergens were biochemically characterized using SDS-PAGE, circular dichroism analysis, and mass spectrometry. Their IgE reactivity was demonstrated by immunoblotting and ELISA and their allergenic activity was proven using rat basophil leukaemia cells transfected with the human FcεRI. Using synthetic peptides I could map sequential IgE-epitopes on the two allergens and I was able to show in case of both allergens also the presence of conformational IgE epitopes. These two recombinant allergens can be used for component resolved diagnosis of patients suffering from cow’s milk allergy. I further utilized the IgE-reactive and biologically active allergens for the development of a novel diagnostic system, consisting of an allergen microarray and a mediator release assay. The microarray technology has the advantage that a large panel of allergens can be evaluated in parallel especially when only small samples of serum are available as for infants and children. The combination with a biological assay allows identifying cow’s milk allergic patients that suffer from severe systemic reactions. This diagnostic system might therefore represent a useful diagnostic tool for highly allergic cow’s milk allergic patients where in vivo tests can not be applied because of the risk of allergic reactions. Another part of my thesis was focused on the investigation of immunological mechanisms involved in non-IgE-mediated cow’s milk allergic reactions. Determination of IgG1-4 subclass and IgA antibody levels to purified recombinant allergens showed that based on their humoral immune response to cow’s milk antigens, persons suffering from non-IgE-mediated cow’s milk intolerance can not be discriminated from persons without cow’s milk intolerance. We therefore concluded that antibody-mediated forms of hypersensitivity against cow’s milk allergens, besides those mediated by IgE, play no or only a minor role in cow’s milk intolerance. In summary, I was able to develop tools for component resolved diagnosis of IgE-mediated and non-IgE-mediated cow’s milk allergy and to gain information that might in the future lead to the design of new strategies for treatment of cow’s milk allergy.

Autor*innen

Heidrun Hochwallner

Haupttitel (Englisch)

Immune responses to cow's milk allergens

Hauptuntertitel (Englisch)

molecular allergen characterization and epitope mapping

Paralleltitel (Deutsch)

Immunantworten auf Kuhmilchproteine ; molekulare Allergencharakterisierung und Epitop-Mapping

Publikationsjahr

2009

Umfangsangabe

130 S. : Ill., graph. Darst.

Sprache

Englisch

Beurteiler*innen

Wayne Thomas ,

Robert Hamilton

Klassifikation

44 Medizin > 44.45 Immunologie

AC Nummer

AC07452502

Utheses ID

7413

Studienkennzahl

UA | 091 | 438 | |

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