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In vitro models for ectopic expression of telomerase template variants
Dorian Hammerl
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molecular Biology
Betreuer*in
Klaus Holzmann
DOI
10.25365/thesis.77920
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-28808.34675.736693-7
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
In den meisten menschlichen Krebszellen werden die Telomere durch den Telomerase-Enzymkomplex aufrechterhalten. Dieser besteht aus einer reversen Transkriptase (hTERT) und einer leitenden RNA-Untereinheit (hTERC) besteht, die als Vorlage für die telomer-Sequenzen dient. Die Mehrheit der Telomere besteht aus hochrepetitiven TTAGGG-Hexameren. Jüngste Studien haben auch so genannte nicht-kanonische telomerische Wiederholungsvarianten (NCTRs) in menschlichen Zellen identifiziert, von denen einige mit bestimmten Krebsarten in Verbindung gebracht wurden. Diese Arbeit zielt darauf ab, in vitro Krebszellmodelle zu entwickeln und zu charakterisieren, die hTERC mit und ohne Mutationen in der Template-Region, die für kanonische (CTRs) und nicht-kanonische telomerische Wiederholungen (NCTRs) kodiert, überexprimieren. Im Rahmen dieser Masterarbeit wurden acht Krebszelllinien untersucht, um vier geeignete Kandidaten für hTERC-Überexpressionsexperimente auszuwählen, indem Puromycin-Zytotoxizitätstests und endogenen hTERT/hTERC-Expression mittels real-time qPCR (RT-qPCR) durchgeführt wurden. Plasmidkonstrukte für hTERC-Überexpression, die für nicht-kanonische TAAGGG- und TGAGGG-Wiederholungen sowie eine spezielle TCAGGG Variante kodieren, wurden mittels Mutagenese (Site-directed mutagenesis) erstellt. Anschließend wurde die Überexpression von ektopischem hTERC, das für CTRs und NCTRs kodiert, in den Krebszelllinien HT1080, T98G, Saos2 und U2OS mittels Lipofektion und retrovirale Transduktion induziert. Transiente und stabile hTERC-Überexpression sowie die stabile Integration der künstlichen Zielgene wurden mittels RT-qPCR geprüft. Zusätzlich wurde die Telomeraseaktivität von Telomerase-aktiven (TA) Überexpressionsklonen (HT1080 und T98G) mittels qPCR-TRAP-Assays untersucht. Schließlich wurde die Integration von TTAGGG- und TCAGGG-Wiederholungen durch Telomerase in künstliche telomerische Oligomere und in genomische DNA in ausgewählten HT1080- und T98G-Klonen mittels RT-qPCR- und Telo-FISH-Assays bewertet. Transiente Überexpression von hTERC wurde in HT1080- und T98G-Klonen 48 Stunden nach der Lipofektion nachgewiesen. Ein signifikanter Anstieg der hTERC-Expression wurde in allen stabilen Überexpressionsklonen von HT1080, T98G, U2OS und Saos2 nach Puromycin-Selektion festgestellt. Die Analyse der genomischen DNA deutete ebenfalls auf eine stabile Integration der Zielkonstrukte in stabilen Klonen hin. Darüber hinaus führte die Überexpression von hTERC zu einer signifikanten Erhöhung der Telomeraseaktivität im Vergleich zu den unbehandelten parentalen Zelllinien in 8 von 10 etablierten hTERC-Überexpressionsklonen der TA-Zelllinien HT1080 und T98G. Eine vorläufige in vitro Analyse zeigte eine erhöhte Integration von TTAGGG- und TCAGGG-Hexameren in künstlichen telomerischen Oligomeren bei HT1080- und T98G-Klonen. Kein signifikanter Anstieg an NCTRs in genomischer DNA wurde in Klonen mit mutierten hTERC-Varianten unter in situ Bedingungen festgestellt. Ein HT1080-Klon zeigte jedoch eine signifikant erhöhte CTR-Integration nach stabiler Überexpression von wild type-hTERC. Zusammenfassung wurden hTERC-Überexpressionsmodelle erfolgreich etabliert, und eine erhöhter Telomeraseaktivität in den meisten TA-Klonen nachgewiesen werden. Obwohl ein Anstieg in CTR/NCTR-Integration nur bedingt nachweißbar war, bieten diese Modelle Potenzial für zukünftige Validierungsstudien zu verbesserten qPCR-Methoden zur Quantifizierung von telomerischen Hexamervarianten. Dies könnte eine Alternative zum aktuellen Gold Standard, dem Next Generation Sequencing (NGS) darstellen.
Abstract
(Englisch)
In most human cancer cells, telomeres are maintained by the telomerase enzyme complex, consisting of a reverse transcriptase (hTERT) associated with a guiding RNA subunit (hTERC) acting as a template for telomeric repeats. The majority of telomeres consist of highly repetitive TTAGGG repeats. Recent studies have also identified non-canonical telomeric repeat (NCTR) variants in human cells, some of which are linked to certain cancer types. This thesis aimed to develop and characterize in vitro cancer cell models overexpressing hTERC with and without mutations in the template region coding for canonical (CTRs) and non-canonical telomeric repeats. This master thesis project aimed to develop and characterize in vitro cancer cell models overexpressing hTERC with and without mutations in the template region coding for (CTRs) and NCTRs. Eight cancer cell lines were screened for four suitable candidates for hTERC overexpression experiments using Puromycin cytotoxicity assays and endogenous hTERT/hTERC expression analysis via real-time qPCR (RT-qPCR). Plasmid constructs for hTERC overexpression coding for non-canonical TAAGGG and TGAGGG repeats, and a special variant coding for TCAGGG repeats, were created using site-directed mutagenesis. Subsequently, overexpression of ectopic hTERC coding for CTRs and NCTRs was induced in cancer cell lines HT1080, T98G, Saos2, and U2OS by Lipofection and Retroviral Transduction. Transient and stable total hTERC overexpression, as well as stable integration of the artificial target genes, was evaluated using RT-qPCR. Additionally, telomerase activity of Telomerase-active (TA) overexpression clones (HT1080 and T98G) was assessed using qPCR-TRAP assays. Finally, incorporation of TTAGGG and TCAGGG repeats via Telomerase into artificial telomeric oligomers and genomic DNA was evaluated in selected HT1080 and T98G clones via RT-qPCR and Telo-FISH assays. Successful transient overexpression of hTERC was shown in HT1080 and T98G clones 48 hours after Lipofection. A significant increase in expression of hTERC was established in all stable overexpression clones of HT1080, T98G, U2OS, and Saos2 after Puromycin selection. Analysis of genomic DNA also suggested stable integration of the target constructs in stable clones. Additionally, overexpression of hTERC induced a significant increase in telomerase activity compared to the untreated parental cell lines in 8 out of 10 established hTERC overexpression clones of the TA cell lines HT1080 and T98G. Preliminary in vitro analysis indicated elevated TTAGGG and TCAGGG repeat incorporation in artificial telomeric oligomers in the respective HT1080 and T98G clones. No significant increase in NCTR incorporation in genomic DNA was detected in clones with mutant hTERC variants under in situ conditions. However, one HT1080 clone showed significantly increased CTR incorporation after stable wild-type hTERC overexpression. Overall, hTERC overexpression models were successfully established, with increased telomerase activity in most TA clones. While CTR/NCTR incorporation was limited, these models offer potential for future validation studies of improved qPCR methods for quantifying telomeric repeat variants, offering an alternative to Next Generation Sequencing (NGS).
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Telomer qPCR NCTR hTERC Krebszelllinie Telomeraseaktivität
Schlagwörter
(Englisch)
telomere qPCR NCTR hTERC cancer cell line telomerase activity
Autor*innen
Dorian Hammerl
Haupttitel (Englisch)
In vitro models for ectopic expression of telomerase template variants
Paralleltitel (Deutsch)
In vitro Modelle für ektopische Expression von Telomerase Template Varianten
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
VII, 80 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Klaus Holzmann
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
44 Medizin > 44.81 Onkologie
AC Nummer
AC17466418
Utheses ID
74742
Studienkennzahl
UA | 066 | 865 | |