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Development of a mass spectrometric technique to measure protein turnover
Thomas Iellici
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Chemie
Betreuer*in
Samuel Matthias Meier-Menches
DOI
10.25365/thesis.80215
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-13246.60040.888539-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Messung der Proteinabundanz in Zellen mittels Proteomischer Techniken ermöglicht die Proteomweite Bestimmung von Protein Halbwertszeiten. Das Ziel dieser Arbeit war es, eine Methode zu entwickeln, die eine robuste und reproduzible Bestimmung von Halbwertszeiten erlaubt. Die Methode wird angewendet, um Proteom-weite Veränderungen in der Protein Abbaurate zu bestimmen, die aufgrund einer Behandlung mit Proteolysis targeting chimeras (PROTACs) auftreten. PROTACs sind heterobifunktionelle Moleküle, die sehr spezifisch Proteine in Zellen und Geweben abbauen. Dabei nutzen PROTACs das körpereigene Ubiquitin-Proteasom System aus, das generell für den Großteil des Proteinabbaus im Körper verantwortlich ist. Der durch PROTACs induzierte Protein Abbau wird meistens durch Endpunkt Perturbationsexperimente bewiesen. Diese Art von Experimenten ermöglicht es jedoch nicht, den durch die PROTAC Behandlung verursachten Anteil am Proteinabbau vom Körpereigenen Anteil zu unterscheiden. Die Grundvermutung lautet, dass PROTACs die Halbwertszeiten einer großen Anzahl von Proteinen beeinflussen. Um die Vermutung überprüfen zu können, wurde zuerst ein Zellkultur Modellsystem in einem metabolischen Gleichgewichtszustand ausgewählt, das alle für die PROTAC Funktion notwendigen Proteine in ausreichender Abundanz exprimiert. Mit Phorbol myristat acetat (PMA) differenzierte HL-60 Leukämie Zellen wurden als Modellsystem ausgewählt. Der metabolische Gleichgewichtszustand ermöglicht die Messung des Proteinabbaus, ohne dass Faktoren wie eine nicht einheitliche Verteilung des Zellzyklus oder Zellzyklus abhängige Änderungen der Proteinexpression beachtet werden müssen. Methodische Parameter, wie die Länge des chromatographischen Gradienten, die Datenbank Suchparameter und die Behandlungskonzentrationen, wurden an das ausgewählte Modellsystem angepasst und für die Protein Halbwertszeit Bestimmung optimiert. Ein 140 Minuten langer Gradient, sowie ein auf einem einzigartigen Peptid basierten Datenbank Suchparameter wurden im Rahmen der Versuche angewendet, um die Anzahl der identifizierten Proteine zu maximieren. Ein auf Zeitreihen basierender Versuch hat es ermöglicht, den Einfluss zwei verschiedener PROTAC Behandlungen auf Protein Halbwertszeiten zu identifizieren. Im Rahmen der Zeitreihen wurde die Cycloheximid chase Methode erfolgreich angewandt, wobei gleichzeitig mit der PROTAC Behandlung eine Inhibition der Protein Neusynthese mittels einer 10 µM Cycloheximid Konzentration erfolgte. Der Abfall der Proteinabundanz nach der Behandlung wurde über acht Stunden verfolgt. Die baseline Protein Abbaurate im Modellsystem wurde in einem weiteren Experiment mit ausschließlicher Cycloheximid Behandlung ermittelt. Weiters wurde das Proteasom mit Bortezomib inhibiert, um den PROTAC induzierten Abbau von Zielproteinen zu verifizieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine in vitro Methode zur Messung von Proteom-weiten Protein Halbwertszeiten erfolgreich entwickelt. Weiters wurde zum Ersten Mal die Aktivität von PROTACs mittels Messung des Protein Abbaus gemessen. Der effiziente Abbau von den, aus Literatur bekannten, SMARCA2 und PBRM1 Zielproteinen konnte für die ACBI2 PROTAC bestätigt werden. Die Inhibition des Proteasoms mittels Bortezomib hatte keinen Einfluss auf den Abbau der Zielproteine der PROTAC. Die experimentelle, Gold basierte metallo-PROTAC konnte das erwartete Zielprotein TXNRD1 nicht abbauen. Ein stringentes Filtern der experimentell nachgewiesenen Proteine hat gezeigt, dass der Median der Protein Halbwertszeiten im Kontrollzustand (44 IDs, 15 Stunden) höher war als mit Cycloheximid Behandlung (133 IDs, 11.53 Stunden). Weiters waren die Median Halbwertszeiten sowohl bei gleichzeitiger Cycloheximid, ACBI2 PROTAC Behandlung (320 IDs, 13.32 Stunden) als auch bei simultaner Cycloheximid, Gold PROTAC Behandlung (166 IDs, 10.54 Stunden) geringer als im Kontrollzustand. Das Experiment ermöglichte die Identifizierung von Proteinen mit experimentellen Halbwertszeiten unter 20 Stunden. Zudem ermöglichte das Experiment PROTAC spezifische Auswirkungen auf die Halbwertszeit von jenen Proteinen zu ermitteln, die sowohl in Cycloheximid als auch in Cycloheximid PROTAC Zuständen identifiziert wurden. Die Gold PROTAC Behandlung führte zu geringeren Halbwertszeiten bei 78% der Proteine deren Halbwertszeit in beiden Bedingungen identifiziert wurden. Die ACBI2 PROTAC Behandlung führte zu niedrigeren Halbwertszeiten in 71% der Proteine, die in beiden Bedingungen identifiziert wurden. Dies beweist, dass PROTACs einen Effekt auf einen weitaus größeren Pool an Proteinen ausüben als eigentlich erwartet. Diese Erkenntnis stellt einen weiteren wichtigen Baustein zum besseren Verständnis des Wirkmechanismus dieser Verbindungen dar.
Abstract
(Englisch)
The proteome-wide assessment of protein turnover can be achieved by the measurement of protein abundance levels over time. Such information can be valuable to the understanding of drug modes of action. The goal of this work was to develop a reliable method to assess the protein turnover in cells on a proteome-wide scale. The method is used to measure changes in protein degradation rates that occur upon treatment with Proteolysis targeting chimeras (PROTACs). PROTACs are heterobifunctional molecules that can specifically degrade proteins in cells and tissues. PROTACs make use of the ubiquitin proteasome system to degrade proteins, which is the main physiological degradation mechanism for proteins. Protein degradation induced by PROTACs is commonly demonstrated by means of endpoint perturbation experiments. Such experimental approaches, however, lack the ability to differentiate between the PROTAC induced share to the protein degradation and the physiological degradation over time. We hypothesized that PROTAC treatments would affect half-lives of a significant number of proteins. Consequently, we identified a cell culture model system in a metabolic steady state, that displayed an adequate expression of proteins that were crucial for the PROTAC mode of action. Phorbol myristate acetate (PMA) differentiated HL-60 leukemia cells were selected as a steady state model system. The steady state model system allows the measurement of protein degradation without the need to account for potential confounding factors, such as non-uniform cell cycle distributions or cell cycle dependent changes in protein expression patterns. Methodical parameters, including the length of the chromatographic gradient, the database search parameters and the treatment concentrations, were adapted to the model system and optimized for a robust protein half-life determination. A 140-minute chromatographic gradient and a one-unique peptide database search strategy were employed to maximize the number of protein identifications. A timeseries-based experimental design based on the Cycloheximide chase method was successfully employed for this work, since it allowed to identify the effect of PROTAC treatments on protein half-lives. A $10\ \mu M$ concentration of Cycloheximide was used to inhibit de-novo protein synthesis in the model system to assess the baseline protein degradation rates. The PROTAC effects on protein degradation rates were assessed in a separate experiment under inhibited protein synthesis. The decrease in protein abundance over time was then chased over the course of up to eight hours after the treatment. A proteasomal inhibition with Bortezomib was also performed in order to verify PROTAC-induced target degradation. In this work we successfully developed an in vitro method that allows the assessment of proteome-wide protein degradation. It marks the first occasion where PROTAC activity was investigated by the measurement of protein degradation. The efficient degradation of literature-known target proteins was confirmed for the fully optimized ACBI2 PROTAC. The proteasomal inhibition with Bortezomib did not prevent the degradation of the reported ACBI2 PROTAC target proteins SMARCA2 and PBRM1. The experimental, gold-based metallo-PROTAC was not found to degrade the expected target protein TXNRD1. A strict protein filtering threshold over the experimental timepoints revealed that the median half-lives of proteins in the control condition (44 IDs, 15 hours) was higher than in the Cycloheximide condition (133 IDs, 11.53 hours); as well as the combined Cycloheximide, ACBI2 PROTAC treatment condition (320 IDs, 13.32 hours) and the combined Cycloheximide, gold PROTAC treatment (166 IDs, 10.54 hours). The employed setup mainly selected protein IDs with half-lives in the sub-20-hour range. The setup also allowed the detection of PROTAC specific effects on protein half-lives for protein IDs shared between the Cycloheximide and the combined Cycloheximide, PROTAC treatment conditions. The gold PROTAC treatment led to shorter half-lives in 78% of shared entries, whereas the ACBI2 PROTAC treatment reduced half-lives in 71% of protein IDs shared with the Cycloheximide condition. This confirms our hypothesis that PROTACs exert an effect on a much wider pool of proteins than expected. This finding represents a further step to better understand the mode of action of PROTACs.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Analytische Chemie Proteolysis targeting chimera (PROTAC) Proteomics Massenspektrometrie Proteinumsatz Proteinabbau
Schlagwörter
(Englisch)
Analytical chemistry Proteolysis targeting chimera (PROTAC) Proteomics Mass spectrometry Protein turnover Protein degradation
Autor*innen
Thomas Iellici
Haupttitel (Englisch)
Development of a mass spectrometric technique to measure protein turnover
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
XI, 89 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Samuel Matthias Meier-Menches
Klassifikation
35 Chemie > 35.26 Massenspektrometrie
AC Nummer
AC17771061
Utheses ID
74906
Studienkennzahl
UA | 066 | 862 | |