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Modelling of adeno-associated virus-production processes using HEK293-specific genome-scale metabolic models
Leopold Zehetner
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doktoratsstudium Naturwissenschaften: Chemie
Betreuer*in
Jürgen Zanghellini
DOI
10.25365/thesis.78419
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-11688.65764.114750-5
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-basierte Gentherapie (GT) bietet vielversprechende Möglichkeiten zur Behandlung genetischer Erkrankungen, jedoch bleiben die hohen Produktionskosten ein wesentliches Hindernis. Die Verbesserung der rAAV-Herstellungseffizienz ist entscheidend für die Erweiterung ihrer klinischen Anwendbarkeit. Diese Dissertation zielt darauf ab, diese Herausforderung durch die Implementierung HEK293-stammspezifischer genomweiter genome-scale metabolic models (GSMMs) in Kombination mit Multi-Omics-Datensätzen zur Optimierung der rAAV-Produktion zu bewältigen. Als erster Schritt rekonstruierten wir 80 GSMMs aus zwei HEK293-Stämmen über fünf Zeitpunkte hinweg. Diese Modelle ermöglichten Einblicke in die metabolischen Unterschiede zwischen hoch- und niedrigproduzierenden Stämmen und identifizierten HIF-1α als einen Schlüsselregulator in den niedrigproduzierenden Zellen. Durch die Inhibition von HIF-1α konnten wir das Zellwachstum erfolgreich stoppen und die spezifische AAV-Kapsidproduktion um das 2,5-fache steigern. Diese Intervention führte jedoch gleichzeitig zu einer Verringerung der Anzahl viraler Genome, da HIF-1α eine entscheidende Rolle im pentose phosphate pathway (PPP) spielt, der für die Nukleotidsynthese essenziell ist. Diese Ergebnisse verdeutlichen die komplexen Kompromisse im metabolischen Engineering für die rAAV-Produktion. Um die rekonstruierten GSMMs systematisch zu vergleichen und zu analysieren, verwendeten wir die logistic principal component analysis (LPCA), eine Methode, die speziell für die Verarbeitung großer GSMM-Datensätze entwickelt wurde. LPCA ermöglicht eine effiziente Clusterbildung und Identifikation der Stoffwechselwege, die die beobachteten Unterschiede bestimmen, was insbesondere im Kontext automatisierter GSMM-Rekonstruktionen von Bedeutung ist. Diese Methode verbessert die Interpretierbarkeit metabolischer Modelle und erleichtert gezielte Eingriffe zur Steigerung der rAAV-Produktion. Über HEK293-Zellen hinaus stellt die Produktion von virusähnlichen Partikeln (VLPs) in verschiedenen Wirtszelllinien zusätzliche Herausforderungen für GT-Anwendungen dar. Der Bedarf an robusten und skalierbaren Produktionsplattformen wird durch die Variabilität des Wirtszellstoffwechsels sowie die Auswirkungen der viralen Vektorreplikation auf zelluläre Signalwege verstärkt. Diese Übersicht beschreibt die modernsten Methoden zur Integration von GSMMs in VLP-produzierende Zelllinien, geht auf bestehende Einschränkungen ein und hebt Optimierungsmöglichkeiten hervor. Insgesamt trägt diese Dissertation zur Weiterentwicklung der rAAV- und VLP-Produktion bei, indem sie computergestütztes Modellieren mit Multi-Omics-Ansätzen kombiniert und so den Weg für effizientere und kostengünstigere Produktionsstrategien in der GT ebnet.
Abstract
(Englisch)
Recombinant adeno-associated virus (rAAV)-based gene therapy (GT) holds significant promise for treating genetic disorders, yet the high costs associated with its production remain a major bottleneck. Improving rAAV manufacturing efficiency is crucial for expanding its clinical applicability. This dissertation aims to address this challenge by implementing HEK293 strain-specific genome-scale metabolic models (GSMMs) combined with multi-omics datasets to optimize rAAV production. As a first step, we reconstructed over 80 GSMMs from two HEK293 strains across five time points. These models provided insight into metabolic differences between high- and low-producing strains, identifying HIF-1α as a key regulator in the low-producing cells. By inhibiting HIF-1α, we successfully stalled cellular growth and increased specific rAAV capsid production by 2.5-fold. However, this intervention also led to a simultaneous reduction in viral genome numbers, as HIF-1α plays a critical role in the pentose phosphate pathway (PPP), which is essential for nucleotide biosynthesis. These findings highlight the complex trade-offs in metabolic engineering for rAAV production. To systematically compare and analyze the reconstructed GSMMs, we employed logistic principal component analysis (LPCA), a method specifically designed to handle large sets of GSMMs. LPCA allows for efficient clustering and identification of metabolic pathways driving observed differences, which is particularly useful in the context of automated GSMM reconstructions. This method enhances the interpretability of GSMMs, facilitating targeted interventions for improving rAAV production. Beyond HEK293 cells, virus-like particle (VLP) production in various host cell lines presents additional challenges in GT applications. The need for robust and scalable production platforms is exacerbated by the variability in host cell metabolism, as well as the impact of viral vector replication on cellular pathways. The review outlines the state-of-the-art methodologies for GSMM integration into VLP-producing cell lines, addressing current limitations and highlighting opportunities for process optimization. Overall, this dissertation contributes to the advancement of rAAV and VLP production by integrating computational modeling with multi-omics approaches, paving the way for more efficient and cost-effective GT manufacturing strategies.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Gentherapie rAAV Bioprozess Optimierung Mathematische Modellierung Omics Daten
Schlagwörter
(Englisch)
Gene therapy rAAV Bioprocess optimization Mathematical modelling Omics data
Autor*innen
Leopold Zehetner 
Haupttitel (Englisch)
Modelling of adeno-associated virus-production processes using HEK293-specific genome-scale metabolic models
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
115 Seiten in verschiedenen Seitenzählungen : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Reingard Grabherr ,
Lars Peter Nielsen
Klassifikation
35 Chemie > 35.23 Analytische Chemie. Allgemeines
AC Nummer
AC17534492
Utheses ID
75233
Studienkennzahl
UA | 796 | 605 | 419 |