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Developing tools to study MuSK and Lrp4 during neuromuscular disorders
Alp Kaan Kutay
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molecular Microbiology, Microbial Ecology and Immunobiology
Betreuer*in
Ruth Herbst
DOI
10.25365/thesis.78398
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-25458.69978.395821-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die neuromuskuläre Endplatte (NMJ) ist die hochspezialisierte Verbindung zwischen einem peripheren Motoneuron und einer Skelettmuskelzelle. Diese chemische Synapse wandelt vom Gehirn ausgelöste Stimulation in Muskelkontraktion um und ermöglicht Bewegung und Atmung. Ihre Entwicklung wird durch die Muskel-spezifische Kinase (MuSK), eine Rezeptor-Tyrosinkinase (RTK), sowie das lipoproteinrezeptor-verwandte Protein 4 (Lrp4) und das vom Motoneuron abgeleitete Proteoglykan Agrin gesteuert. Gemeinsam kontrollieren sie die Assemblierung der Acetylcholin-Neurotransmitterrezeptoren (AChRs) zu funktionellen Einheiten. Erkrankungen der NMJ sind oft schwerwiegend und teils lebensbedrohlich. Ihre Vielfalt und unterschiedliche Symptomatik machen Diagnose und personalisierte Therapie entscheidend. Myasthenia gravis (MG) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch Autoantikörper gegen Schlüsselproteine der NMJ wie Lrp4, MuSK oder AChR verursacht wird. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde ein zellbasierter Assay mit HeLa-Zellen entwickelt, um Lrp4-positive MG-Patientenseren zu identifizieren. Hierfür wurde das PiggyBac-System genutzt, um stabile HeLa-Zelllinien zu erzeugen, die mCherry-markiertes Lrp4 überexprimieren. Obwohl die Färbung mit einem kommerziellen Antikörper erfolgreich war, zeigte keines der getesteten Patientenseren eine positive Diagnose. Das System benötigt daher weitere Optimierung, um höhere Sensitivität und Zuverlässigkeit zu gewährleisten, bleibt jedoch ein vielversprechender Ansatz. Im zweiten Teil wurden die Auswirkungen der seltenen MuSK-Mutationen N103S und L545P auf AChR-Clustering untersucht. Die Experimente erfolgten mit zwei Modellen: MuSK-Knockout-Myotuben mit ektoper Expression von Wildtyp- oder mutiertem MuSK und Wildtyp-Myotuben mit induzierbarer MuSK-Überexpression. Die MuSK-/- Zellen zeigten erhebliche Probleme in ihrer Differenzierung und im AChR-Clustering, was sie als Modell derzeit unzuverlässig macht. Theoretisch sind sie jedoch besser geeignet, wenn technische Herausforderungen überwunden werden. In den Wildtyp-Myotuben mit MuSK-Überexpression zeigte sich nach Agrin-Stimulation eine vergleichbare AChR-Clusterbildung bei mutierten und Wildtyp-MuSK-Zelllinien. Dies deutet darauf hin, dass in Anwesenheit von endogenem Wildtyp-MuSK die Mutationen die MuSK-Aktivierung nicht beeinflussen. Weitere Untersuchungen zu MuSK-Expressionsniveau und -Aktivierung sind notwendig, um belastbare Daten zu erhalten. Diese Arbeit beleuchtet die Herausforderungen und das Potenzial der Systeme, um MG und CMS besser zu verstehen. Trotz technischer Einschränkungen liefern die Ansätze wichtige Einblicke für zukünftige diagnostische und therapeutische Entwicklungen.
Abstract
(Englisch)
The neuromuscular junction (NMJ) is the highly specialized connection between a peripheral motor neuron and a skeletal muscle cell. This chemical synapse transforms brain-elicited stimulation into muscle contraction and enables us to move and to breathe. Development of NMJ is governed by Muscle Specific Kinase (MuSK), a receptor tyrosine kinase (RTK) together with lipoprotein receptor-related protein 4 (Lrp4) and the motor-neuron-derived proteoglycan Agrin, which control the assembly of the acetylcholine neurotransmitter receptors (AChRs) into functional units. Diseases affecting the NMJ are severe, sometimes even life-threatening. These disorders are diverse and present distinct symptoms. Their heterogeneity makes diagnosis and personalized therapy the key factors in treatment of patients. Myasthenia gravis (MG) is an autoimmune disease caused by autoantibodies against key molecules of the neuromuscular junction such as Lrp4, MuSK or AChR. In the first part of this thesis, a cell-based assay using HeLa cells was developed to identify Lrp4-positive MG patient sera. For this purpose, the PiggyBac system was used to generate stable HeLa cell lines able to overexpress mCherry-tagged Lrp4. Although staining with a commercial antibody was successful, none of the available patient sera tested showed a positive diagnosis. This suggests that the system needs further optimization to ensure higher sensitivity and reliability. However, the concept remains promising, especially if existing challenges are addressed. In the second part of this thesis, the effects of two rare MuSK mutations, N103S and L545P, on AChR clustering were investigated. The experiments were performed using two models: MuSK knockout myotubes with ectopic expression of wildtype or mutant MuSK and wildtype myotubes with inducible MuSK overexpression. The MuSK-/- cells showed significant problems in their differentiation and AChR clustering, making them currently unreliable as a model. However, theoretically, they are the better model to study MuSK mutations if these technical challenges are overcome. In the wildtype myotubes with MuSK overexpression, the results indicated that upon agrin stimulation, the ability of myotubes to form AChR clusters was comparable for both of the mutant MuSK cell lines compared to the wildtype MuSK cell line. This suggests that in the presence of endogenous wildtype MuSK the mutations do not affect MuSK activation. Further investigations on MuSK expression level and activation are required to generate conclusive data from this model system. In summary, this work highlights both the challenges and the potential of the systems used to better understand MG and CMS. While technical limitations influenced the results, the approaches and findings provide important insights into future diagnostic and therapeutic developments.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
neuromuskuläre Synapse Autoimmunerkrankungen
Schlagwörter
(Englisch)
Neuromuscular junction MuSK Lrp4 Myasthenia gravis Congenital myasthenic syndromes Cell-based assay Signal transduction Autoimmune disease
Autor*innen
Alp Kaan Kutay
Haupttitel (Englisch)
Developing tools to study MuSK and Lrp4 during neuromuscular disorders
Paralleltitel (Deutsch)
Entwicklung von Werkzeugen zur Untersuchung von MuSK und Lrp4 bei neuromuskulären Erkrankungen
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
90 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Ruth Herbst
Klassifikationen
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie ,
44 Medizin > 44.78 Immunkrankheiten
AC Nummer
AC17532399
Utheses ID
75423
Studienkennzahl
UA | 066 | 830 | |