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Towards the in-situ visualization of tRNA-derived small RNAs
Diana Kokoric
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Biologische Chemie
Betreuer*in
Stefan Ameres
DOI
10.25365/thesis.78425
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-10031.92433.192416-0
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Detektion von tRNA-abgeleiteten kleinen RNAs (tsRNAs) stellt eine besondere Herausforderung dar, da ihre geringe Größe, die identische Sequenz zu ihren parentalen tRNAs und das niedrige Verhältnis von tsRNAs zu parentalen tRNAs die spezifische Erfassung erschweren. Methoden wie die Hybridisierungs-Kettenreaktion (HCR) und die Rolling Circle Amplification (RCA) in Kombination mit Fluorescent in situ Hybridization (FISH) bieten vielversprechendes Potenzial zur in situ-Signalverstärkung von tsRNAs. Die größte Herausforderung besteht jedoch darin, die wenigen vorhandenen tsRNAs zuverlässig von ihren parentalen tRNAs mit derselben Sequenzinformation zu unterscheiden. Aufbauend auf früheren Ansätzen, die HCR zur Detektion spezifischer 5’-tsRNAs während der oxidativen Stressantwort nutzten und dabei die 3’ zyklische Phosphatgruppe (cycP) als charakteristisches Merkmal von 5’-tsRNAs ausnutzten, zielte dieses Projekt darauf ab, bestehende methodische Limitationen zu überwinden. Insbesondere wurden neue Oligonukleotid-Sonden zur spezifischen tsRNA-Detektion entworfen und Hybridisierungsbedingungen optimiert, um die Ligationseffizienz der Sonden zu verbessern. Eine zentrale Strategie bestand darin, eine hybride RNA-DNA-Sequenz zu erzeugen, indem eine spezifische DNA-Sonde an das 3’-Ende einer tsRNA ligiert wurde. Diese hybride Sequenz dient als Andockstelle für eine Padlock-Sonde, wodurch RCA ausschließlich an erfolgreich ligierten Produkten initiiert werden kann. Diese Arbeit beschreibt die systematische Optimierung der Padlock-Sonden-Hybridisierung sowie die Amplifikation der Padlock-Sequenzen in vitro und in vivo durch Anwendung des Ansatzes auf den Nachweis ektopischer tsRNAs in menschlichen somatischen Zellen. Ziel dieser Studie war es insbesondere, unspezifische Hintergrundsignale von parentalen tRNAs zu minimieren und eine hochsensitive sowie spezifische Methode zur Visualisierung von tsRNAs zu entwickeln.
Abstract
(Englisch)
The detection of tRNA-derived small RNAs (tsRNAs) is complicated by their size, their sequence, which is identical to their parental tRNAs, and the low ratio of tsRNAs/parental tRNAs. While methodologies such as hybridization chain-reaction (HCR) and rolling circle amplification (RCA) combined with fluorescent in situ hybridization (FISH), present promising potential for in situ signal amplification of tsRNAs, the greatest caveat is to distinguish the few tsRNAs from tRNAs with the same sequence information. Building on previous attempts that utilized HCR for the detection of specific 5’ tsRNAs during the oxidative stress response, which leveraged on exploiting the 3’ cyclic phosphate (cycP) moiety, a distinct feature of 5’ tsRNAs, this project aimed at overcoming a number of identified limitations in applying HCR to the problem of distinguishing tsRNAs from parental tRNAs. Specifically, new oligonucleotide probe designs for detecing tsRNAs and hybridzation conditions to optimize ligation efficiencies of probes were tested. As a result, a hybrid RNA-DNA sequence formed by ligating a unique DNA probe to the 3’ end of a specific tsRNA should serve as the landing site for a pad-lock probe design from which RCA can be initiated only at successfully ligated products. This work described the systematic testing and refining of the pad-lock probe hybridization and the amplification of pad-lock sequences in vitro as well as in vivo through applying the approach to the detection of ectopic tsRNAs in human somatic cells. Our aim is to particularly address the spurious background signal from parental tRNAs.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
tRNA-Fragmente tsRNAs RTCB-Ligation Rolling Circle Amplification RCA in situ Detektion
Schlagwörter
(Englisch)
tRNA fragments tsRNAs RTCB Ligation Rolling Circle Amplification RCA in situ Detection
Autor*innen
Diana Kokoric
Haupttitel (Englisch)
Towards the in-situ visualization of tRNA-derived small RNAs
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
vii, 70 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Stefan Ameres
AC Nummer
AC17534902
Utheses ID
75507
Studienkennzahl
UA | 066 | 863 | |