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Combining DNA-PAINT with iSCAT
towards super-resolution imaging based on elastic scattering
Emanuel Traiger
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Physik
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Physics
Betreuer*in
Thomas Juffmann
DOI
10.25365/thesis.78775
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-28337.81934.755036-1
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Lichtmikroskopie gehört weiterhin zu den wichtigsten Werkzeugen zur Untersuchung der mikroskopischen Welt. Da die zu untersuchenden Proben immer kleiner, die ablaufenden Prozesse schneller und die experimentellen Umgebungen zunehmend komplexer werden, müssen sich mikroskopische Techniken entsprechend weiterentwickeln. In dieser Arbeit wird die Kombination der superauflösenden Technik DNA-PAINT mit der hochempfindlichen interferometrischen Streumikroskopie (iSCAT) untersucht. Als Marker wurden elastisch streuende Goldnanopartikel (GNPs) mit einem Durchmesser von 20nm verwendet. Wir gehen davon aus, dass diese Kombination mehrere Vorteile bietet: GNPs sind weniger anfällig für Umwelteinflüsse als viele fluoreszierende Marker, unterliegen keiner Photobleiche und ermöglichen dadurch längere Messzeiten. Zudem reduzieren sie die Phototoxizität, erlauben aufgrund eines erhöhten Photonbudgets kürzere Belichtungszeiten, bieten eine höhere axiale Auflösung und könnten die multiplexe Bildgebung vereinfachen. Als Modellsystem zur Demonstration der Umsetzbarkeit unseres Ansatzes haben wir eine 2D-DNA-Origami-Struktur mit definierten Bindungsstellen im Abstand von 40 und 60nm angepasst. Die GNPs wurden funktionalisiert, um transient an diese Dockingstellen zu binden. Es wurde ein dual-modales iSCAT-Mikroskop aufgebaut, das sowohl die Detektion von 20nm großen GNPs als auch simultane Fluoreszenzmessungen ermöglicht. Theoretische Simulationen der Punktspreizfunktionen (PSFs) sagten einen Kontrast von etwa 8% unter idealen Bedingungen voraus, der mit den experimentellen Ergebnissen verglichen wurde. Zur Charakterisierung des Aggregationsverhaltens der funktionalisierten GNPs wurden dynamische Lichtstreumessungen (DLS) unter verschiedenen Salzkonzentrationen, pH-Werten und Funktionalisierungsprotokollen durchgeführt. Wir konnten zeigen, dass unser Aufbau in der Lage ist, 20nm große GNPs zuverlässig zu detektieren, wenngleich eine Verbesserung der axialen Fokussierung notwendig ist. DNA-Origami-Strukturen wurden erfolgreich synthetisiert und mittels konventionellem DNA-PAINT nachgewiesen. Gelelektrophorese bestätigte ihre Stabilität auch bei Puffern mit geringer Magnesiumkonzentration. Es zeigte sich, dass GNPs in Anwesenheit zweiwertiger Kationen deutlich schneller aggregieren als bei einwertigen Ionen, wobei Aggregationsschwellen bei 10mM MgCl2 und 500 μM ZnCl2 beobachtet wurden, während sie bis zu 1M NaCl und KCl stabil blieben. Eine Absenkung des pH-Werts verringerte die Aggregation zusätzlich. Diese Ergebnisse bilden eine solide experimentelle Grundlage für die Kombination von iSCAT und DNA-PAINT und schaffen die Basis für zukünftige Entwicklungen wie eine verbesserte Markerspezifität, erweiterte Multiplexing-Strategien und automatisierte Partikelverfolgungsalgorithmen.
Abstract
(Englisch)
Light microscopy remains one of the most important tools for studying the microscopic world. As the samples we want to investigate become smaller and the processes faster, and as experimental environments become increasingly complex, microscopy techniques must adapt accordingly. This thesis explores the combination of the super-resolution microscopy technique DNA-PAINT with the highly sensitive interferometric scattering (iSCAT) technique by employing elastically scattering gold nanoparticles (GNPs) with a diameter of 20 nm as labels. We hypothesize that this combination provides several advantages: GNPs are less sensitive to environmental influences than many fluorescent labels, do not photobleach, and thereby enable longer measurement durations. Additionally, they offer reduced phototoxicity, allow short exposure times due to an increased photon budget, enable higher axial precision, and potentially simplify multiplexed imaging. We adapted a 2D DNA origami structure with well-defined binding sites, spaced 40 and 60 nm apart, as a model system to demonstrate the feasibility of our approach. The GNPs were functionalized to transiently bind to these docking sites. We constructed a dual-modality iSCAT microscope capable of detecting 20 nm GNPs and performing simultaneous fluorescence measurements. Theoretical simulations of the point spread functions (PSFs) predicted a contrast of approximately 8% under ideal conditions, which we compared with our experimental results. To characterize the aggregation behavior of the functionalized GNPs, we performed dynamic light scattering (DLS) measurements under various salt concentrations, pH values, and functionalization protocols. We demonstrated that our setup is capable of detecting 20 nm GNPs, although further improvements in axial focusing are necessary. DNA origami structures were successfully synthesized and detected using conventional DNA-PAINT. Gel electrophoresis confirmed that they remained stable even in low magnesium buffer conditions. We found that aggregation of GNPs occurs significantly faster in the presence of divalent cations compared to monovalent ions, with aggregation thresholds observed at 10 mM MgCl2 and 500 μM ZnCl2, while remaining stable up to 1 M NaCl and KCl. Lowering the pH was observed to further reduce aggregation. These findings establish a robust experimental foundation for combining iSCAT with DNA-PAINT and lay the groundwork for future developments, including improved label specificity, advanced multiplexing strategies, and automated particle tracking algorithms.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
interferometrische Streumikroskopie iSCAT DNA-PAINT superauflösende Mikroskopie Goldnanopartikel GNPs DNA-Origami dynamische Lichtstreuung DLS Funktionalisierung von Nanopartikeln Aggregationsverhalten Punktspreizfunktion PSF Streukontrast
Schlagwörter
(Englisch)
interferometric scattering microscopy iSCAT DNA-PAINT super-resolution microscopy gold nanoparticles GNPs DNA origami dynamic light scattering DLS nanoparticle functionalization aggregation behavior point spread function PSF scattering contrast
Autor*innen
Emanuel Traiger
Haupttitel (Englisch)
Combining DNA-PAINT with iSCAT
Hauptuntertitel (Englisch)
towards super-resolution imaging based on elastic scattering
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
74 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Thomas Juffmann
Klassifikation
33 Physik > 33.18 Optik
AC Nummer
AC17590955
Utheses ID
75756
Studienkennzahl
UA | 066 | 876 | |