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Optimierung der Probenvorbereitung für Kryoschnitte zur Analyse mittels MALDI-MS
Vanessa Struckl
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Pharmazie
Betreuer*in
Sabine Glasl-Tazreiter
Mitbetreuer*in
Elisabeth Ginko
DOI
10.25365/thesis.78281
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-10158.85734.444790-8
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Bei intensiver mikroskopischer Analyse von Pflanzenorganen (Blätter, Wurzeln und andere), trifft man häufig auf mehr oder weniger auffällige Strukturen, die teilweise gut zu beschreiben aber schwer interpretierbar sind. Dabei handelt es sich z. B. um typisch gefärbte Zellen oder um Inhalte, die sich nach der Präparation während des Beobachtens verändern, wie z. B. kristalline oder amorphe Zellinhalte. Es ist anzunehmen, dass diese Beobachtungen auf eine Vielzahl von Inhaltsstoffen zurückzuführen sind, die sich in den entsprechenden Zellen befinden. Versucht man, durch Recherche in einschlägiger Literatur nähere Informationen zu den beobachteten Phänomenen zu erhalten, so findet man wenig bis keinerlei Information. Das heißt, obwohl diverse Strukturen auffällig sind, fehlen deren Beschreibung und Charakterisierung oftmals in der gängigen Literatur. Dies liegt vermutlich darin begründet, dass zwar das beobachtete Phänomen auffällig ist, aber die Erklärung, warum dieses Erscheinungsbild auftritt, schuldig geblieben werden muss, weshalb solche Strukturen erst gar nicht Erwähnung finden. Diese Wissenslücken bedürfen einer Klärung und tragen dazu bei, den anatomischen Kenntnisstand zu verbessern, um damit eventuell auch neue wissenschaftliche Ansätze für die Lokalisation von Inhaltsstoffen in bestimmten Geweben zu liefern. In der Human- und Tierhistologie sind bereits verschiedene Methoden zur Untersuchung von Zellveränderungen, zur Lokalisation von Biomolekülen und für die Immunhistochemie etabliert, während die Forschung in der Pflanzenwelt noch in ihren Anfängen steckt. Ein möglicher Grund dafür sind die speziellen Eigenschaften pflanzlicher Gewebe, welche die Probenvorbereitung verkomplizieren. Insbesondere die starren Zellwände, der hohe Wassergehalt und die großen Vakuolen machen die Kryosektion anspruchsvoll. Die Aufgabe dieser Masterarbeit bestand darin, die Probenvorbereitung von Kryoschnitten zu erarbeiten und optimieren. Ziel war es, geeignete Methoden der Einbettung, Einfrierung, Lagerung, und Schneidetechniken zu finden, die es erlauben, solche Präparate weiterführenden Analysen wie z. B. MALDI-MS zuzuführen. Die erarbeiteten Präparationstechniken sollen die Voraussetzungen liefern dafür, dass die speziell präparierten Pflanzenschnitte mittels spezieller Bildgebungsverfahren und massenspektrometrischer Analysen vermessen werden können, um Inhaltsstoffe “in situ“ zu charakterisieren bzw. identifizieren. Dazu wurden unterschiedliche Pflanzen und Organe für die Probenvorbereitung ausgewählt (Monstera deliciosa – Luftwurzeln, Ruscus aculeatus – Wurzeln, Acorus calamus – Wurzeln, Foeniculum vulgare – Früchte, Myrrhis odorata – Früchte. Aloe vera – Blätter, Piper ornatum – Blätter, Citrus x limon – Blätter, Myrtus communis – Blätter, Eucalyptus globulus – Blätter). Zunächst wurden für jede Pflanze sogenannte „Positivkontrollen“ in Form von Wasser- und Chloralhydrat-Präparaten angefertigt. Letztendlich wurden dieselben Proben entweder ohne Einbettung oder eingebettet in Carmellose-Natrium mittels Flüssigstickstoffs eingefroren und am Kryostat-Mikrotom bei unterschiedlichen Schnittdicken geschnitten. Die Erarbeitung der Probenvorbereitung war grundsätzlich erfolgreich. Insgesamt zeigen die Untersuchungen, dass Wurzeln und Sprosse ohne Einbettungsmedium am Kryostat-Mikrotom geschnitten werden können. Hingegen benötigt fragileres Probenmaterial wie Blätter und Früchte eine zusätzliche Stabilisierung durch CMC. Es konnte außerdem herausgefunden werden, dass die Pflanzenhistologie die Anfertigung von dickeren Schnitten (ca. 40-60 µm) notwendig macht verglichen mit humanem oder tierischem Gewebe (5-10 µm).
Abstract
(Englisch)
During intensive microscopic analysis of plant organs (leaves, roots and others), one often encounters conspicuous structures, some of which are easy to describe but difficult to interpret. These are, for example, typically colored cells or contents that change after preparation during observation, such as crystalline or amorphous cell contents. It can be assumed that these observations are due to a variety of substances contained in the corresponding cells. If one attempts to obtain more detailed information on the observed phenomena by researching the relevant literature, little or no information is found. This means that although various structures are conspicuous, their description and characterization are often missing in the current literature. This is presumably due to the fact that although the observed phenomenon is conspicuous, the explanation as to why this appearance occurs has to be omitted, which is why such structures are not even mentioned. These gaps in knowledge need to be clarified and contribute to improving the level of anatomical knowledge to possibly provide new scientific approaches for the localization of substances in certain tissues. In human and animal histology, various methods have already been established for investigating cell changes, localizing biomolecules and for immunohistochemistry, while research in the plant world is still in its infancy. One possible reason for this is the special properties of plant tissue, which complicate sample preparation. In particular, the rigid cell walls, the high water content and the large vacuoles make cryosectioning challenging. The task of this master's thesis was to develop and optimize the sample preparation of cryosections. The aim was to find suitable methods of embedding, freezing, storage and cutting techniques that allow such preparations to be subjected to further analyses such as MALDI-MS. The preparation techniques developed should provide the prerequisites for the specially prepared plant sections to be measured using special imaging methods and mass spectrometric analyses to characterize or identify ingredients ‘in situ’. Different plants and organs were selected for sample preparation (Monstera deliciosa - aerial roots, Ruscus aculeatus - roots, Acorus calamus - roots, Foeniculum vulgare - fruits, Myrrhis odorata - fruits. Aloe vera - leaves, Piper ornatum - leaves, Citrus x limon - leaves, Myrtus communis - leaves, Eucalyptus globulus - leaves). Initially, so-called ‘positive controls’ were prepared for each plant in the form of water and chloral hydrate preparations. Finally, the same samples were frozen either without embedding or embedded in carboxymethylcellulose using liquid nitrogen and cut on the cryostat microtome at different cutting thicknesses. The preparation of the samples was generally successful. Overall, the investigations show that roots and shoots can be cut on the cryostat microtome without an embedding medium. However, more fragile sample material such as leaves and fruits require additional stabilization with carboxymethylcellulose. It was also found that plant histology requires the preparation of thicker sections (approx. 40-60 µm) compared to human or animal tissue (5-10 µm).
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
MALDI-MS Kryosektion Pflanzen Probenvorbereitung
Autor*innen
Vanessa Struckl
Haupttitel (Deutsch)
Optimierung der Probenvorbereitung für Kryoschnitte zur Analyse mittels MALDI-MS
Paralleltitel (Englisch)
Optimisation of sample preparation for cryosections for analysis using MALDI-MS
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
92 Seiten : Illustrationen
Sprache
Deutsch
Beurteiler*in
Sabine Glasl-Tazreiter
Klassifikation
30 Naturwissenschaften allgemein > 30.03 Methoden und Techniken in den Naturwissenschaften
AC Nummer
AC17517060
Utheses ID
75792
Studienkennzahl
UA | 066 | 605 | |