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Docking a flexible basket onto the core of the nuclear pore complex
Edvinas Stankunas
Art der Arbeit
Dissertation
Universität
Universität Wien
Fakultät
Zentrum für Molekulare Biologie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Doctor of Philosophy-Doktoratsstudium Molecular Biosciences Molekulare Biologie
Betreuer*in
Alwin Köhler
DOI
10.25365/thesis.79664
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-23117.10690.476352-6
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die Kompartimentierung des intrazellulären Milieus in membrangebundenen Kompartimenten ist das entscheidende Merkmal der eukaryotischen Zelle. Der Kern wird von der Kernhülle (NE) umschlossen, die aus der inneren und äußeren Kernmembran besteht und als physische Barriere zwischen Genom und Zytoplasma dient. Der Kernporenkomplex (NPC) ist das einzige Tor, das den bidirektionalen Transport von Makromolekülen wie Proteinen und RNAs zwischen Kern und Zytoplasma vermittelt. Das evolutionär konservierte Kerngerüst des NPC besteht aus einem Stapel koaxialer Ringe, die in die fusionierten Doppelmembranen des NEs eingebettet sind. Das Kerngerüst besteht aus einem inneren Ring der zwischen zwei äußeren Ringen eingebettet ist und über seine porenmembranüberspannenden Transmembrandomänen am luminalen Ring verankert wird. Das Kerngerüst des NPC dient als starre Andockplattform für die Permeabilitätsbarriere des NPC, die für den selektiven Charakter des nukleozytoplasmatischen Transports verantwortlich ist. Das Funktionsrepertoire des NPC-Kerngerüsts wird durch periphere Anhängsel erweitert, die sowohl zu transportbezogenen als auch zu transportunabhängigen Funktionen beitragen. Während die zytoplasmatische Seite des NPC-Kerngerüsts von flexiblen zytoplasmatischen Filamenten geschmückt wird, ist die nukleoplasmatische Seite durch eine auffällige fischfallenartige Struktur – den so genannten nukleären Korb – gekennzeichnet. Trotz der bekannten Rolle des nukleären Korb bei der Kopplung der Transkription an die mRNA-Qualitätskontrolle ist der Mechanismus, mit dem er an die äußeren Ringe des NPC-Kerngerüsts andockt, bislang nicht bekannt. Die Entschlüsselung der molekularen Details dieses Andockmechanismus ist das Hauptziel dieser Doktorarbeit. Durch die Integration von AlphaFold-basierten Protein-Protein-Interaktions-Screens, membrangesteuerter biochemischer Rekonstitution, elektronenmikroskopischen Untersuchungen von Mlp1-Kernfilamenten und Fluoreszenzmikroskopie an lebenden Hefezellen wurde eine membranverankerte dreiteilige Verbindung zwischen dem nukleären Korb und dem NPC-Kerngerüst aufgedeckt. Die Korb-Untereinheit Nup60 besteht aus drei benachbarten kurzen linearen Motiven (SLiMs), die Mlp1, ein paralleles Homodimer aus Coiled-Coil-Segmenten die durch flexible Scharniere unterbrochen sind, mit der Nup85-Untereinheit des Y-Komplexes, einem Schlüsselbaustein der äußeren Ringe, verbinden. Die biochemische Sektion der Nup60-SLiMs ergab eine eingebaute Redundanz der multivalenten NPC-Kern-Korb-Verbindung, die Störungen aufgrund von Verengungen und Dehnungen des NPC-Kerngerüsts ausgleichen kann. Die makromolekulare Baugruppe aus Y-Komplex, Nup60 und Mlp1, die eine minimale Kerngerüst-Korb-Verbindung darstellt, wurde auf einer synthetischen Membran rekonstituiert. Dabei zeigte sich, dass der Y-Komplex und Mlp1 um die Bindung an Nup60 konkurrieren, was zuvor nicht erwartet wurde. Darüber hinaus wurden die kartierten Protein-Protein-Schnittstellen in vivo validiert, was neue Erkenntnisse über die Bildung von perinukleären Mlp1-Foci bei spezifischen genetischen Störungen lieferte. Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass die helikale Region (HR) von Nup60 in vitro eine Dimerisierung (oder Oligomerisierung höherer Ordnung) durchläuft, was eine molekulare Erklärung für die zuvor vorgeschlagene stabilisierende Wirkung der doppelten Kernringe auf den nukleären Korb liefert. Die SLiM-basierte Proteinverbindung an der Schnittstelle zwischen dem Kerngerüst des NPC und dem nukleären Korb bietet eine mechanistische Erklärung dafür, wie Struktur und Funktion des NPC umgestaltet werden können und wie die posttranslationalen Modifikationen den Montagezustand des NPC beeinflussen könnten. Diese Arbeit verbessert unser Verständnis der kompositorischen und konformationellen Heterogenität von NPCs und schafft eine Grundlage für zukünftige strukturell-funktionelle Studien des nukleären Korbs. Darüber hinaus verspricht der integrative Ansatz, der ein in silico-Hochdurchsatz-Screening mutmaßlicher Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einer in vitro-Charakterisierung und in vivo-Validierung der kartierten Wechselwirkungen verbindet, viel für die Charakterisierung anderer komplexer makromolekularer Mechanismen.
Abstract
(Englisch)
The compartmentalization of the intracellular milieu into a membrane-bound compartments is the defining feature of the eukaryotic cell. The nucleus is enclosed by the nuclear envelope (NE), which consists of inner and outer nuclear membranes, and serves as a physical barrier between the genome and cytoplasm. The nuclear pore complex (NPC) is the sole gateway mediating the bidirectional trafficking of macromolecules – proteins and RNAs – between the nucleus and cytoplasm. The evolutionarily conserved core scaffold of NPC features a stack of coaxial rings embedded in the membranes of the NE. The core scaffold consists of an inner ring, which is sandwiched between two outer rings, and is anchored to the luminal ring via its pore membrane-spanning transmembrane domains. The core scaffold of NPC serves as a relatively rigid docking platform for the permeability barrier of the NPC, which is responsible for the selective nature of nucleocytoplasmic transport. The functional repertoire of the NPC core scaffold is expanded by peripheral appendages, which contribute to both transport-related and transport-unrelated functions. While the cytoplasmic face of the NPC core scaffold is decorated by flexible cytoplasmic filaments, the nucleoplasmic face is decorated by a prominent fishtrap-like structure known as the nuclear basket. Despite the well-established role of the nuclear basket in coupling transcription to mRNA quality control, the mechanism by which it docks onto the outer rings of the NPC core scaffold has remained elusive. Deciphering the molecular details of this docking mechanism constitutes the major aim of this doctoral thesis. By integrating AlphaFold-based protein–protein interaction screens, membrane-templated biochemical reconstitution, electron microscopy studies of Mlp1 nuclear filaments and live yeast cell fluorescence microscopy, a membrane-anchored tripartite junction between the nuclear basket and NPC core scaffold was uncovered. The basket subunit Nup60 harbours three adjacent short linear motifs (SLiMs), which connect Mlp1—a parallel homodimer composed of coiled-coil segments interrupted by flexible hinges—to the Nup85 subunit of the Y-complex, a key building block of the outer rings. The biochemical dissection of SLiMs revealed an in-built redundancy of the multivalent NPC core–basket junction, which may accommodate for disruptions caused by constrictions/dilations of the NPC core scaffold. The macromolecular assembly consisting of the Y-complex, Nup60 and Mlp1, which represents a minimal core scaffold-nuclear basket junction, was reconstituted on a synthetic membrane, revealing previously unanticipated competition between the Y-complex and Mlp1 for their binding to Nup60. Furthermore, mapped protein–protein interfaces were validated in vivo, yielding novel insights into the formation of Mlp1 perinuclear foci upon specific genetic perturbations. In addition, the helical region (HR) of Nup60 was demonstrated to undergo dimerization (or higher order oligomerization) in vitro, providing a molecular explanation for the previously proposed nuclear basket-stabilizing effect of the double nuclear rings. The SLiM-based protein junction at the interface between the core scaffold of NPC and the nuclear basket offers a mechanistic explanation for how NPC structure and function can be reshaped, and how the post-translational modifications could affect the assembly state of the NPC. This work advances our understanding of the compositional and conformational heterogeneity of NPCs and establishes a foundation for future structural-functional studies of the nuclear basket. Moreover, the integrative approach combining high-throughput in silico screening of putative protein–protein interactions with in vitro characterization and in vivo validation of mapped interactions holds great promise for characterizing other complex macromolecular machineries.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
Kernporenkomplex Nup60 Mlp1
Schlagwörter
(Englisch)
nuclear pore complex nuclear basket Nup60 Mlp1
Autor*innen
Edvinas Stankunas
Haupttitel (Englisch)
Docking a flexible basket onto the core of the nuclear pore complex
Paralleltitel (Deutsch)
Andocken eines flexiblen Korbes an den Kern des Kernporenkomplexes
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
95 Seiten in verschiedenen Seitenzählungen : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*innen
Martin Hetzer ,
Shotaro Otsuka
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC17717056
Utheses ID
75980
Studienkennzahl
UA | 794 | 620 | 490 |