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Differentiation of pear cultivars using PCR with high resolution melting analysis
Sofie Chi Schandl
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Chemie
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Lebensmittelchemie
Betreuer*in
Margit Cichna-Markl
DOI
10.25365/thesis.78827
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-25222.17099.858084-4
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Das Ziel dieser Masterarbeit war es, zu untersuchen, ob die Polymerase Kettenreaktion (PCR) kombiniert mit der Hochauflösenden Schmelzkurvenanalyse (HRM) für die Unterscheidung von Birnensorten verwendet werden kann. Die Differenzierung von Sorten ist aufgrund zunehmender Lebensmittelverfälschungen von wachsendem Interesse. Für die Differenzierung der Birnensorten wurde zuerst die DNA mittels DNA-Extraktionskits isoliert. Anschließend wurden die DNA-Proben mit Birnen- und Apfel-Primerpaaren, die auf Mikrosatelliten (SSRs) abzielen, mittels PCR und anschließender HRM untersucht. Der erste Teil der Masterarbeit beschäftigt sich mit der Differenzierung von 18 Birnensorten unter der Verwendung von DNA-Extrakten aus Blättern. 15 Primerpaare (sechs Primerpaare, die auf das Birnengenom abzielen und neun Primerpaare, die auf das Apfelgenom abzielen) wurden getestet. Mit allen Birnen-Primerpaaren und allen Apfel-Primerpaaren, mit Ausnahme von einem, wurden PCR-Produkte für alle Sorten erhalten. Die Unterscheidung zwischen Sorten unterschiedlicher Spezies (Pyrus communis und Pyrus pyrifolia) war einfacher als die Unterscheidung zwischen Sorten der gleichen Spezies. Für die Differenzierung aller 18 Birnensorten waren nur drei Primerpaare notwendig. Eines der 15 Primerpaare erwies sich dabei als am geeignetsten, weil es die Unterscheidung von fast 88 % der 18 Sorten ermöglichte. Der zweite Teil der Masterarbeit beschäftigt sich mit der Differenzierung von drei Birnensorten (Anjou, Cheeky und Williams) unter Verwendung von DNA-Proben aus Schale, Fruchtfleisch und selbst hergestellten Säften. Aufgrund der niedrigen DNA-Konzentration in den DNA-Extrakten der Säfte wurde eine Optimierung der DNA-Extraktion mit zwei DNA-Extraktionskits, NucleoSpin Plant II und DNeasy mericon Food Kit, durchgeführt. Mit dem modifizierten Protokoll des DNeasy mericon Food Kits wurde eine höhere DNA-Konzentration in den DNA-Proben erzielt, welche dann erfolgreich für die Differenzierung mit Apfel- und Birnen-Primerpaaren verwendet wurden. Die selbsthergestellten Säfte wurden hitzebehandelt, um den Effekt der thermischen Pasteurisierung auf die DNA-Konzentration der Extrakte und deren Amplifizierbarkeit mittels PCR zu untersuchen. Die Resultate zeigten, dass eine Hitzebehandlung die DNA-Konzentration in den Extrakten reduzierte, was zu einer Erhöhung der Ct-Werte oder sogar zu keinem Anstieg des Fluoreszenzsignals innerhalb von 50 Zyklen führte. Unterschiedliche Temperatur und Dauer bei der Hitzebehandlung hatten einen unterschiedlichen Einfluss auf die DNA-Konzentration und den Ct-Wert der DNA-Proben. Der dritte Teil der Masterarbeit vergleicht die ersten negativen Ableitungen der Schmelzkurven und die normalisierten Schmelzkurven, die für Blatt, Schale, Fruchtfleisch und Säfte der Sorte Williams erhalten wurden. Die DNA wurde mit zwei unterschiedlichen DNA-Extraktionskits, NucleoSpin Plant II und DNeasy mericon Food Kit, extrahiert, was zu DNA-Konzentration von 0.13 bis 35.10 ng/µl führte. Trotz der Unterschiede in Herkunft, in der Durchführung der DNA-Extraktion und der DNA-Konzentration in den Extrakten wurden sehr ähnliche normalisierte Schmelzkurven erhalten, was die Stärke des genetischen Fingerabdrucks und die Robustheit von PCR mit HRM verdeutlicht. Die Arbeit zeigt, dass Birnensorten der Birnenarten Pyrus communis und Pyrus pyrifolia über DNA-Proben aus Blättern, Schale, Fruchtfleisch und Säften mittels PCR-HRM und SSR-Primerpaaren, die auf das Birnen- oder das Apfelgenom abzielen, unterschieden werden können. Pasteurisierte Säfte enthalten wenig intakte DNA und weitere Forschung für die erfolgreiche Differenzierung der Sorten wird benötigt.
Abstract
(Englisch)
The aim of this thesis was to investigate if polymerase chain reaction (PCR) coupled with high resolution melting (HRM) analysis can be used for the differentiation of pear cultivars. The differentiation of cultivars is of growing interest due to the increase in food adulteration. For the differentiation of pear cultivars, DNA was first isolated using commercial DNA extraction kits and then subjected to PCR coupled with HRM targeting microsatellites (SSRs). The differentiation was carried out by pairwise comparing the normalized melting curves. The first part of the thesis deals with the differentiation of 18 pear cultivars using DNA extracts from leaves. Fifteen primer pairs were applied, including six primer pairs targeting the pear and nine primer pairs targeting the apple genome. With all pear primer pairs and all except one apple primer pair, PCR products were obtained for all cultivars. Some of the apple primer pairs were less suitable for the differentiation of pear cultivars. Differentiation between cultivars of different species (Pyrus communis and Pyrus pyrifolia) was easier than the differentiation between cultivars of the same species. For the complete differentiation of the 18 pear cultivars, only three primer pairs would have been necessary. One of the 15 primer pairs proved to be the most suitable one, differentiating almost 88 % of the 18 cultivars. The second part of the thesis focuses on the differentiation of three pear cultivars (Anjou, Cheeky and Williams) using DNA extracts from peel, pulp, and self-produced juices. Due to the low DNA concentration of the DNA extracts of the juices, DNA extraction was optimized using two DNA extraction kits, NucleoSpin Plant II and DNeasy mericon Food Kit. With the modified protocol of DNeasy mericon Food Kit, a higher DNA concentration in the DNA samples was obtained, which were then successfully used for the differentiation with apple and pear primer pairs. The self-produced juices were heat treated to determine the effect of thermal pasteurisation on the DNA concentration of the DNA extracts and its amplifiability by PCR. The results showed that the heat treatment decreased the DNA concentration in the extracts, leading to increased Ct-values or even no increase in the fluorescence signal within 50 cycles. Different heat treatment conditions had a different impact on the DNA concentration and the Ct-values obtained. The third part of the thesis compares the derivative and normalized melting curves obtained from leaf, peel, pulp, and juices from the cultivar Williams. The DNA was extracted with two different DNA extraction kits, NucleoSpin Plant II and DNeasy mericon Food Kit, resulting in DNA concentrations from 0.13 to 35.10 ng/µl. In spite of the differences in origin, the procedure of DNA extraction and the DNA concentration in the extracts, very similar normalized melting curves were obtained, which underlines the strength of the genetic fingerprint and the robustness of PCR coupled with HRM. In summary, PCR-HRM with apple and pear SSR primer pairs was successfully used for the differentiation of pear cultivars of the species Pyrus communis and Pyrus pyrifolia using DNA samples from leaves, peel, pulp and juices. Pasteurised juices contain low intact DNA and need further investigation for the successful differentiation of cultivars.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
PCR Polymerase-Kettenreaktion HRM Hochauflösende Schmelzkurvenanalyse Birnen Saft Lebensmittelverfälschungen
Schlagwörter
(Englisch)
PCR Polymerase Chain Reaction High Resolution Melting Analysis HRM Pears Juice Food Adulteration
Autor*innen
Sofie Chi Schandl
Haupttitel (Englisch)
Differentiation of pear cultivars using PCR with high resolution melting analysis
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
VI, 111 Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Margit Cichna-Markl
Klassifikation
35 Chemie > 35.99 Chemie. Sonstiges
AC Nummer
AC17594695
Utheses ID
76363
Studienkennzahl
UA | 066 | 659 | |