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Deciphering the regenerative potential of axolotl limb connective tissue cells
Klaus Ehrlinger
Art der Arbeit
Masterarbeit
Universität
Universität Wien
Fakultät
Fakultät für Lebenswissenschaften
Studiumsbezeichnung bzw. Universitätlehrgang (ULG)
Masterstudium Molecular Biology
Betreuer*in
Elly Tanaka
DOI
10.25365/thesis.79397
URN
urn:nbn:at:at-ubw:1-26815.26884.429740-5
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(Print-Exemplar eventuell in Bibliothek verfügbar)
Abstracts
Abstract
(Deutsch)
Die genaue Zusammensetzung des Blastemas während der Regeneration von Axolotl-Gliedmaßen ist nicht vollständig geklärt. Frühere Arbeiten zeigten, dass paired-related homeobox 1 (Prrx1) Zellen eine wichtige Rolle spielen, aber es ist unklar, in welchem Ausmaß sie an der Regeneration beteiligt sind. Microarray- und Einzelzell-RNA-Sequenzierungsexperimente (scRNA-Seq) geben Aufschluss über die differentielle Regulation von Blastemazellen während der Regeneration, liefern aber keine ausreichende räumliche Information über die Verteilung von Prrx1+-Zellen im Blastema. In dieser Arbeit zeigen wir eine Kombination aus Cre-loxP-basierter Zelllinienverfolgung und Fluoreszenzmikroskopie, die verwendet wurde, um die Prävalenz von Prrx1+-Zellen über Zeit und Raum im Blastema der Axolotl-Gliedmaßen zu charakterisieren. Microarray- und scRNA-Seq-Daten enthüllten mehrere Gene, die während der Gliedmaßenregeneration eine veränderte Expression zeigen. Um diese Gene besser zu verstehen, wurden Wundheilungsexperimente durchgeführt, um die Auswirkung der Prrx1-Überexpression auf die Zellmobilität zu bestimmen. Prothymosin-alpha-like (Ptal), ein weiteres Gen, das in Microarray- und scRNA-Seq-Experimenten gefunden wurde, wurde ebenfalls funktionell charakterisiert, indem die Wirkung der PTAL-Überexpression auf die Zellproliferation bestimmt wurde. Knock-out-Experimente in Axolotl sind aus verschiedenen Gründen schwierig, die durch den Einsatz von in-situ-Knock-out-Techniken gemildert werden könnten. Konventionelle Knock-out-Experimente werden normalerweise durch die Etablierung von Knock-out-Tierlinien durchgeführt. Die lange Generationszeit von Axolotl macht diesen Ansatz langwierig. Ein weiteres Problem ist, dass Gene, die an der Regeneration beteiligt sind, beim Knock-out wahrscheinlich zu embryonaler Letalität führen würden, da Regeneration und Embryogenese viele funktionelle Gene gemeinsam haben. In den letzten Jahren wurde das Baculovirus (BV) als eine effektive in-situ Transfektionsmethode für Axolotl vorgeschlagen. Durch lokale Infektion des Axolotl-Gliedmaße vor oder während der Regeneration kann die gewünschte Überexpression oder das Knock-out-Konstrukt eingeführt werden, ohne dass transgene Tiere produziert werden müssen. Durch die Optimierung des Produktionsprotokolls konnten wir eine funktionelle Cas9-BV-Produktion etablieren, die Forschern als wichtiges Werkzeug dienen wird.
Abstract
(Englisch)
The exact composition of the blastema during regeneration of axolotl limbs is not completely understood. Earlier work showed that paired related homeobox 1 (Prrx1) expressing cells play an important role during regeneration, but the extent to which they are involved is unclear. Microarray and single-cell RNA sequencing (scRNA-Seq) experiments shed light on the differential regulation of blastema cells during regeneration, but do not provide sufficient spatial information about the distribution of Prrx1+ cells in the blastema. In this work we use a combination of Cre-loxP based lineage tracing and fluorescence microscopy to characterize the prevalence of Prrx1+ cells over time and space in the blastema of axolotl limbs. Microarray and scRNA-Seq data revealed several genes that show differential expression during limb regeneration, which need to be further investigated. To better understand these genes, scratch assays were carried out to determine the effect of Prrx1 overexpression on cell motility. Prothymosin-alpha like (Ptal), another gene found in microarray and scRNA-Seq experiments, was also functionally characterized by determining the effect of Ptal overexpression on cell proliferation. Knock-out experiments in axolotl are difficult due to several reasons that could be mitigated by employment of in-situ knock-out techniques. Conventional knock-out experiments are usually done by establishing knock-out animal lines. A long generation time of axolotl makes this approach tedious. Another problem is that genes that are implicated in regeneration likely would lead to embryonic lethality upon knock-out, since regeneration and embryogenesis share a lot of functional genes. In recent years, baculovirus (BV) was proposed as an effective in-situ transfection method for axolotl. By local infection of axolotl limb prior to or during regeneration, the desired overexpression or knock-out construct can be introduced without producing transgenic animals. While overexpression of genes with baculovirus was already possible, Cas9 expressing baculovirus has not been successfully produced. By streamlining and optimizing the production protocol, we were able to establish functional Cas9-BV production, which will serve as an important tool for researchers in axolotl.
Schlagwörter
Schlagwörter
(Deutsch)
axolotl regeneration blastema baculovirus
Autor*innen
Klaus Ehrlinger
Haupttitel (Englisch)
Deciphering the regenerative potential of axolotl limb connective tissue cells
Publikationsjahr
2025
Umfangsangabe
67 ungezählte Seiten : Illustrationen
Sprache
Englisch
Beurteiler*in
Elly Tanaka
Klassifikation
42 Biologie > 42.13 Molekularbiologie
AC Nummer
AC17669218
Utheses ID
76384
Studienkennzahl
UA | 066 | 865 | |